[发明专利]阿胶制品中明胶来源的鉴定方法

权利要求书

1.一种阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，其特征在于，包含如下步骤：

阿胶制品的预处理：用去离子水将阿胶制品在50±5℃水浴锅溶解制成的阿胶溶液，向所述阿胶溶液中加入牛明胶和猪明胶，搅拌均匀制成阿胶-牛明胶-猪明胶混合溶液；混合溶液置于离心机中离心，所得上清液进一步过滤，将得到的滤液冻干，备用；

样品的酶解：将冻干后的样品溶解于SDT缓冲液制成溶液，溶液于沸水中加热，然后离心10～20min，上清液置于超滤离心管中，加入UA缓冲液，置于离心机离心去除上清液，往浓缩物中加入UA缓冲液后再次离心10～20min去除上清液；然后加入IAA的乙醇溶液，于暗室放置20～40min后再次离心10～20min去除上清液；然后加入UA缓冲液，离心10～20min去除上清液，重复此加料、离心操作2次；再加入NH₄HCO₃水溶液并10～20min离心去除上清液，重复加料、离心操作2次；最后，在浓缩物中加入含胰蛋白酶的NH₄HCO₃水溶液，37±2℃放置过夜后离心，收集上清液即得到明胶多肽溶液；

高效液相色谱-质谱检测：明胶多肽溶液上样于Easy nLC-Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪检测，采用的柱子为C18柱，流动相A为含有甲酸体积分数0.1%甲酸的水溶液；流动相B为84%的乙腈和16%的水混合溶剂中含有体积分数0.1%的甲酸，在250 nl/min的流速下洗脱60min，由流动相A线性梯度变化为流动相B，采用数据依赖采集模式动态收集丰度最高的10个母离子进行HCD裂解，动态排除时间为20 s，归一化碰撞能量为27eV；

数据分析：采用MASCOT软件匹配分析所获得的质谱图，数据库设置为目标胶原蛋白数据库，检索参数包括：半胱氨酸经碘乙酰胺为固定修饰；氧化为可能性修饰；最大的未酶切位点为2；一级质谱错误率为±20 ppm；二级质谱错误率为±0.1 Da；当Mascot分数大于40时，多肽峰被认定为阳性鉴定或准确度极高（P＜0.05）；依据三种胶原蛋白理论特征性多肽数据库进行阿胶、牛明胶和猪明胶特征性多肽的比对分析，确定阿胶制品中明胶来源。

2.根据权利要求1所述的阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，其特征在于，所述阿胶制品包括阿胶块、阿胶口服液、阿胶颗粒、阿胶糕。

3.根据权利要求1所述的阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，其特征在于，所述阿胶溶液为阿胶制品和去离子水按料水比80～120mg/mL的比例混合溶解而成；按配置阿胶溶液所用的阿胶制品质量1%的量向阿胶溶液中分别加入牛明胶和猪明胶，牛明胶和猪明胶的质量均为阿胶制品质量的1%。

4.根据权利要求1所述的阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，其特征在于，所述步骤1中，上清液经过0.45μm的过滤器过滤获得滤液。

5.根据权利要求1所述的阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2中，SDT缓冲液中SDS的质量百分含量为4%～5%，二硫苏糖醇的浓度为100～110mM、pH8 Tris-HCl的浓度为150～160mM，其余为水；冻干后的样品溶解于所述SDT缓冲液制成冻干后的样品浓度为1μg/μL的溶液；沸水中加热时间为2～5min；所述超滤离心管的截留分子量为10kDa；所述UA缓冲液中尿素的浓度为6～10M，pH8.0 Tris-HCl的浓度为150mM，其余为水；所述IAA的乙醇溶液中IAA的浓度为50～60mM；所述NH₄HCO₃水溶液中NH₄HCO₃浓度为25mM；所述含胰蛋白酶的NH₄HCO₃水溶液中胰蛋白酶的浓度为2μg/40μL，NH₄HCO₃浓度为25mM。

6.根据权利要求1所述的阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，其特征在于，所述10个母离子的m/z范围为300-1800。

7.根据权利要求1所述的阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，其特征在于，所述目标胶原蛋白为驴皮、牛皮和猪皮胶原蛋白。