[发明专利]阿胶制品中明胶来源的鉴定方法

说明书

本发明公开了一种阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，包含如下步骤：1.阿胶制品的预处理：阿胶制品水溶液加入牛明胶和猪明胶；固液分离、过滤，滤液冻干；2.样品的酶解：冻干样品经过SDT缓冲液、UA缓冲液、IAA、NH₄HCO₃水溶液处理；最后加入含胰蛋白酶的NH₄HCO₃水溶液，离心，即得到明胶多肽溶液；3.高效液相色谱‑质谱检测：明胶多肽溶液上样于Easy nLC‑Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪检测；4.数据分析：采用MASCOT软件匹配分析所获得的质谱图，数据库设置为目标胶原蛋白数据库，确定阿胶制品中明胶来源。本发明所述方法能够快速准确的鉴定阿胶制品中明胶来源，操作简单，成本低廉，鉴定精度高，误差较小。

技术领域

本发明属于鉴定方法技术领域，尤其涉及一种阿胶制品中明胶来源的鉴定方法。

背景技术

阿胶是采用马科动物驴的鲜皮或干燥皮经去毛漂泡、煎煮、浓缩、并加入各类辅料制成的固体胶类药物，也被称为驴皮胶。其与人参、鹿茸三者一起被称为“中药三宝”，首载于《神农本草经》，并被列为上品。阿胶具有滋阴补血，润燥，止血的功效，其补血功效已被证实。除补血外，阿胶在增强免疫力、抗疲劳、抗辐射、保护大脑、促进骨愈合生长以及保护心血管等方面的功效都已被证实。由于其重要性，阿胶产业现已融入健康中国发展战略。

发明内容

本发明提供了一种阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，包含如下步骤：

1. 阿胶制品的预处理：用去离子水将阿胶制品在50±5℃水浴锅溶解制成的阿胶溶液，向所述阿胶溶液中加入牛明胶和猪明胶，搅拌均匀制成阿胶-牛明胶-猪明胶混合溶液；混合溶液置于离心机中离心，所得上清液进一步过滤，将得到的滤液冻干，备用；

2. 样品的酶解：将冻干后的样品溶解于SDT缓冲液制成溶液，溶液于沸水中加热，然后离心10～20min，上清液置于超滤离心管中，加入UA缓冲液，置于离心机离心去除上清液，往浓缩物中加入UA缓冲液后再次离心10～20min去除上清液；然后加入IAA的乙醇溶液，于暗室放置20～40min后再次离心10～20min去除上清液；然后加入UA缓冲液，离心10～20min去除上清液，重复此加料、离心操作2次；再加入NH₄HCO₃水溶液并10～20min离心去除上清液，重复加料、离心操作2次；最后，在浓缩物中加入含胰蛋白酶的NH₄HCO₃水溶液，37±2℃放置过夜后离心，收集上清液即得到明胶多肽溶液；

3. 高效液相色谱-质谱检测：明胶多肽溶液上样于Easy nLC-Orbitrap FusionTribrid质谱仪检测，采用的柱子为C18柱，流动相A为含有甲酸体积分数0.1%甲酸的水溶液；流动相B为84%的乙腈和16%的水混合溶剂中含有体积分数0.1%的甲酸，在250 nl/min的流速下洗脱60min，由流动相A线性梯度变化为流动相B，采用数据依赖采集模式动态收集丰度最高的10个母离子进行HCD裂解，动态排除时间为20 s，归一化碰撞能量为27eV；

4. 数据分析：采用MASCOT软件匹配分析所获得的质谱图，数据库设置为目标胶原蛋白数据库，检索参数包括：半胱氨酸经碘乙酰胺为固定修饰；氧化为可能性修饰；最大的未酶切位点为2；一级质谱错误率为±20 ppm；二级质谱错误率为±0.1 Da；当Mascot分数大于40时，多肽峰被认定为阳性鉴定或准确度极高（P＜0.05）；依据三种胶原蛋白理论特征性多肽数据库进行阿胶、牛明胶和猪明胶特征性多肽的比对分析，确定阿胶制品中明胶来源。

进一步地，所述阿胶制品包括阿胶块、阿胶口服液、阿胶颗粒、阿胶糕。

进一步地，所述阿胶溶液为阿胶制品和去离子水按料水比80～120mg/mL的比例混合溶解而成；按配置阿胶溶液所用的阿胶制品质量1%的量向阿胶溶液中分别加入牛明胶和猪明胶，牛明胶和猪明胶的质量均为阿胶制品质量的1%。