[发明专利]无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用

权利要求书

1.无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法，其特征在于，

①氧化：将牛血清白蛋白、乳清蛋白和酪蛋白中的一种或多种溶解于pH5-6之间的乙酸盐缓冲液中，加入氧化剂，将糖链氧化成醛；

②终止氧化：加入乙二醇终止氧化；

③沉淀：室温或4℃下，2000g离心10min-30min；

④透析：取上清液于pH5-6之间的乙酸盐缓冲液中透析，更换数次透析液；

⑤定量：用分光光度法定量惰性蛋白含量。

2.根据权利要求1所述无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法，其特征在于，步骤①中，氧化剂为高锰酸盐或高碘酸盐，氧化剂的终浓度为100-200mmol/L，在0-2℃下不停搅拌，氧化时间为10分钟-1小时。

3.根据权利要求1所述无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法，其特征在于，乙二醇的终浓度为500-1000mmol/L，反应1h-2h。

4.权利要求1-3任意一项制备方法制备得到的无糖链型惰性蛋白封闭剂在异常糖链蛋白检测中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，无糖链型惰性蛋白封闭剂加入结合有待封闭样本的固相的孔或反应杯中，于pH7.00-7.20，4℃过夜或37℃恒温封闭1.5h，每孔或反应杯封闭剂用量：150-300ul，封闭完毕后，进行分离。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，异常糖链蛋白检测的具体步骤如下：

第一步，样本制备及检测

S1样本处理

将待测标本使用样本稀释液稀释至1-20000倍，待测标本充分混匀获得样本液；

S2样本孵育

样本液置于固相A的孔中，所述固相A为聚苯乙烯和/或聚丙烯材质发光板，样本液pH控制在9.40-9.60，室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相A上；或者，样本液置于反应杯，加入固相B，所述固相B为磁性微球，样本液pH控制在7.00-7.20， 室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相B上；

S3分离

针对结合在固相A的，倾倒掉残余的样本稀释液，每孔加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；针对结合在固相B的，将反应杯在磁分离器上静置1min-2min，每个反应杯加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；

S4无糖链型惰性蛋白封闭剂封闭

采用无糖链型惰性蛋白封闭剂，于pH7.00-7.20，4℃过夜或37℃恒温封闭1.5h，每孔或反应杯封闭剂用量：300ul，封闭完毕后，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；

S5生物素标记的凝集素识别糖链异常蛋白

每孔或反应杯使用生物素标记的凝集素的浓度及用量：0.1-10ug/ml，50-200ul， pH：7.00-7.20，反应时间： 室温孵育2-3h或者37℃恒温孵育1h，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离，凝集素与生物素的质量比为1：（1-5）；

S6采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素进行信号放大

辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和SA的标记比例：1：（1-10），每孔或反应杯使用浓度及用量：0.05-0.2ug/ml，50-200ul，pH：7.00-7.20，反应时间： 室温孵育30-60min或者37℃恒温孵育15min，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；

第二步，制作标准曲线

在0-20000ng/ml范围内，制备4个及以上不同质量浓度的异常糖链糖蛋白样品作为标准品，按照步骤S2-S6对标准品进行处理，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪获得发光值，将除0值以外的质量浓度和对应的发光值均转换成以2为底的对数，代入至四参数logistic曲线y = (A - D) / [1 + (x/C)^B] + D，线性拟合得到标准曲线；

第三步，样本浓度的计算

对步骤S6的样品，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪检测获取发光值，代入标准曲线，计算获得待测标本中糖链异常蛋白的浓度。