[发明专利]无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用，无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法：①氧化：将牛血清白蛋白、乳清蛋白和酪蛋白中的一种或多种溶解于pH5‑6之间的乙酸盐缓冲液中，加入氧化剂，将糖链氧化成醛；②终止氧化：加入乙二醇终止氧化；③沉淀：室温或4℃下，2000g离心10min‑30min；④透析：取上清液于pH5‑6之间的乙酸盐缓冲液中透析，更换数次透析液；⑤定量：用分光光度法定量惰性蛋白含量。本发明制备方法制备得到的无糖链型惰性蛋白封闭剂在异常糖链蛋白检测中的应用，无糖链型惰性蛋白封闭剂加入结合有待封闭样本的固相的孔或反应杯中，于pH7.00‑7.20，4℃过夜或37℃恒温封闭1.5h，每孔或反应杯封闭剂用量：150‑300ul，封闭完毕后，进行分离。

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用。

背景技术

蛋白质糖基化作为一种重要的翻译后修饰，对蛋白质结构和功能起着重要的作用，已发现在哺乳动物细胞中，约50％的蛋白有糖基化发生，这种修饰在细胞识别、粘附、细胞间相互作用和生长发育等许多细胞功能中发挥关键作用。

异常糖链糖蛋白主要由糖基化不完全或新的糖基转移酶被激活而产生新的糖基化引起，大量研究表明异常糖链糖蛋白的产生与肿瘤关系密切，如恶性肿瘤患者甲胎蛋白、转铁蛋白、碱性磷酸酶、r-谷氨酰转移酶、人绒毛膜促性腺激素、T抗原、a1抗胰蛋白酶及前列腺酸性磷酸酶等糖链结构发生改变，达到一定程度后，此类物质向血液排放，并较多地存在于外周血液种。

凝集素是一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白。它具有能与糖蛋白专一性、非共价可逆结合的特点。凝集素对糖蛋白的结合强度可随分子相互作用的数目增加，凝集素对糖蛋白的结合解离常数为约Kd10^-5～10^-7。

现有技术中，已经存在利用异常糖链糖蛋白与不同植物凝集素的亲和性，用于各种类型的肿瘤的诊断。但现有技术的检测方法存在如下缺陷：

检测方法的操作步骤存在可优化的空间，现有技术无法实现定量检测，另外封闭剂的选择，影响封闭效果，导致检测结果易受干扰。

发明内容

本发明的目的之一在于解决现有技术的不足 ，提供提供一种无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法。

本发明的目的之二在于提供一种无糖链型惰性蛋白封闭剂的应用，具体为基于无糖链型惰性蛋白封闭剂的异常糖链糖蛋白的检测方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案如下：

无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法：

①氧化：将牛血清白蛋白、乳清蛋白和酪蛋白中的一种或多种溶解于pH5-6之间的乙酸盐缓冲液中，加入氧化剂，将糖链氧化成醛；

②终止氧化：加入乙二醇终止氧化；

③沉淀：室温或4℃下，2000g离心10min-30min；

④透析：取上清液于pH5-6之间的乙酸盐缓冲液中透析，更换数次透析液；

⑤定量：用分光光度法定量惰性蛋白含量。

优选的，步骤①中，氧化剂为高锰酸盐或高碘酸盐，氧化剂的终浓度为100-200mmol/L，在0-2℃下不停搅拌，氧化时间为10分钟-1小时。

优选的，乙二醇的终浓度为500-1000mmol/L，反应1h-2h。

本发明制备方法制备得到的无糖链型惰性蛋白封闭剂在异常糖链蛋白检测中的应用，无糖链型惰性蛋白封闭剂加入结合有待封闭样本的固相的孔或反应杯中，于pH7.00-7.20，4℃过夜或37℃恒温封闭1.5h，每孔或反应杯封闭剂用量：150-300ul，封闭完毕后，进行分离。