[发明专利]一种异常糖链糖蛋白的检测方法

权利要求书

1.一种异常糖链糖蛋白的检测方法，其特征在于，所述检测方法的步骤如下：

第一步，样本制备

S1样本处理

将待测标本使用样本稀释液稀释至1-20000倍，待测标本充分混匀获得样本液；

S2样本孵育

样本液置于固相A的孔中，所述固相A为聚苯乙烯和/或聚丙烯材质发光板，样本液pH控制在9.40-9.60，室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相A上；或者，样本液置于反应杯，加入固相B，所述固相B为磁性微球，样本液pH控制在7.00-7.20， 室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相B上；

S3分离

针对结合在固相A的，倾倒掉残余的样本稀释液，每孔加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；针对结合在固相B的，将反应杯在磁分离器上静置1min-2min，每个反应杯加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；

S4封闭

采用质量百分比0.5%-1.5%的牛血清白蛋白、乳清蛋白和酪蛋白中的一种或多种为封闭剂，于pH7.00-7.20，4℃过夜或37℃恒温封闭1.5h，每孔或反应杯封闭剂用量：300ul，封闭完毕后，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；

S5生物素标记的凝集素识别糖链异常蛋白

每孔或反应杯使用生物素标记的凝集素的浓度及用量：0.1-10ug/ml，50-200ul， pH：7.00-7.20，反应时间： 室温孵育2-3h或者37℃恒温孵育1h，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；

S6采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素进行信号放大

辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和SA的标记比例：1：（1-10），每孔或反应杯使用浓度及用量：0.05-0.2ug/ml，50-200ul，pH：7.00-7.20，反应时间： 室温孵育30-60min或者37℃恒温孵育15min，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；

第二步，制作标准曲线

在0-20000ng/ml范围内，制备4个及以上不同质量浓度的异常糖链糖蛋白样品作为标准品，按照步骤S2-S6对标准品进行处理，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪获得发光值，将除0值以外的质量浓度和对应的发光值均转换成以2为底的对数，代入至四参数logistic曲线y = (A - D) / [1 + (x/C)^B] + D，线性拟合得到标准曲线；

第三步，样本浓度的计算

对步骤S6的样品，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪检测获取发光值，代入标准曲线，计算获得待测标本中糖链异常蛋白的浓度。

2.根据权利要求1所述异常糖链糖蛋白的检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述样本为血清、血浆和体液中的任意一种，步骤S2中，固相A的结合异常糖链蛋白的能力不低于1000ng/cm²，固相B 结合异常糖链糖蛋白的能力不低于80ng异常糖链糖蛋白/10ug磁性微球。

3.根据权利要求2所述异常糖链糖蛋白的检测方法，其特征在于，所述固相A采用96孔发光板，每孔样本量50-200μl，所述固相B的浓度为0.1-0.5mg/ml，每反应杯中样本量10-200μl，固相B的添加量为50-200μl。

4.根据权利要求1所述异常糖链糖蛋白的检测方法，其特征在于，步骤S5中，凝集素与生物素的质量比为1：（1-5）。

5.根据权利要求1所述异常糖链糖蛋白的检测方法，其特征在于，针对固相A的样本稀释液，其组成如下：碳酸钠0.5-1.0g，碳酸氢钠10-15g，纯化水定容至1L；针对固相B的样本稀释液，其组成如下：NaH₂PO₄.2H₂O：0.5-1g，Na₂HPO₄.12H₂O：2-3g，纯化水定容至1L。