[发明专利]基于pH响应的异色纳米颗粒、含有该纳米颗粒的致病菌检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种基于pH响应的异色纳米颗粒、含有该纳米颗粒的致病菌检测试剂盒及检测方法，属于食源性致病菌检测技术领域。本发明的异色纳米颗粒是由pH指示剂分子、BSA、病原微生物的核酸适配体aptamer 1自组装而成；含有该纳米颗粒的致病菌检测试剂盒还包含涂有链霉亲和素的96孔板和5’端修饰生物素的待测目标病原微生物的核酸适配体aptamer 2；本发明的基于pH响应的异色纳米颗粒中，aptamer 1特异性识别致病菌并与之结合，加入OH^‑后产生颜色变化且颜色变化大于空白对照组，利用96孔板可以同时检测多种致病菌，且灵敏性高、特异性好。

技术领域

本发明属于食源性致病菌检测技术领域，具体涉及一种基于pH响应的异色纳米颗粒、含有该纳米颗粒的致病菌检测试剂盒及检测方法。

背景技术

近年来，随着经济全球化进程的加快，食品安全已成为当今全球性公共卫生的焦点。每年由食源性疾病引起的食品安全问题已成为全球公众健康优先考虑的问题。食源性疾病的发病率居各类疾病总发病率的前列，全世界每年约有220万人因感染食源性疾病而丧生。随着我国市场经济的快速发展和人民生活水平的飞速提高，尤其是我国加入世界贸易组织后，消费者对食品安全问题更加关注。我国不仅是一个食品出口大国，也是食品进口大国，根据商务部统计数据显示，我国出口的食品因为食品安全问题每年损失高达170多亿美元，加上食物中毒导致的其它经济损失，总计达到数千亿元。而致病菌是引起食源性疾病的主要原因。

致病菌在自然界分布十分广泛；且随着环境的变化，这些病原微生物的数量和类型也发生着相应的变化。此外，食源性致病微生物污染涉及很多环节，从食品原料种养殖、食品加工、储藏、运输、销售以及烹调等，不仅如此这些致病微生物还会产生并释放毒素造成食物中毒。有效监控食品生产和流通领域的微生物污染，已经成为人们所面临的现实问题。为控制食品中致病菌污染，整合分散在不同食品标准中的致病菌限量规定，我国于2013年12月26日发布了GB 29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》，并已于2014年7月1日起正式实施。国标中规定了肉制品、水产制品、即食蛋制品、粮食制品、即食豆类制品等11类食品中沙门菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌5种致病菌的限量。鉴于食源性致病微生物污染范围广、危害大的特点，迫切需要建立高效、灵敏、准确、经济以及适合于现场快速检测的方法，以减少或避免致病微生物对人体的危害。

目前食品微生物卫生检测涉及的致病菌主要包括沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希式菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌等。检测方法主要包括常规检测方法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法等。食品中这些致病性微生物的检测，多数主要还是依靠传统的培养方法来确定，传统的培养方法一般包括前增菌、选择性增菌、选挥性平板分离、生物化学筛选和血清学鉴定五个步骤，最大的问题是耗时长，不能满足快速检测的要求，无法做出快速判断和选择，对有些细菌往往不能给出理想的鉴定结果。免疫学检测的基本原理是抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。不同的微生物有其特异的抗原并能激发机体产生相应的特异性抗体。近年来，不断发展的免疫荧光技木、酶联免疫技术、放射免疫技术等免疫学方法已逐步应用于致病菌的检测，但仍存在操作繁琐，敏感性偏低等问题。且相比传统方法所需仪器设备要求高，在很大程度上限制了这些方法的应用和推广，大大降低了其实用价值。因此，为了适应现代食品工业对快速检测的需求，急需建立准确、简便、快速、灵敏、特异的食品检测方法。