[发明专利]一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌、生产苯乳酸的方法和应用

权利要求书

1.一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的构建方法为：通过基因工程与代谢工程技术对地衣芽孢杆菌TCCC11148进行改造，包括抑制分支酸向色氨酸途径分支、抑制预苯酸向酪氨酸途径分支、过表达苯乳酸合成酶/氨基转移酶三步分子操作；

所述基因工程菌的构建方法的步骤如下：

⑴以地衣芽孢杆菌TCCC11148为出发菌株，敲除色氨酸合成途径中的邻氨基苯甲酸合成酶基因trpE；

⑵对地衣芽孢杆菌TCCC11148ΔtrpE进行敲除酪氨酸合成途径中的T-预苯酸脱氢酶基因tyrA；

⑶过表达地衣芽孢杆菌TCCC11148ΔtrpEΔtyrA乳酸脱氢酶基因ldh，即得高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌；

具体步骤如下：

⑴邻氨基苯甲酸合成酶基因trpE的敲除

①以GenBank编号CP033218的地衣芽孢杆菌TCCC11148基因组为模板，根据其trpE基因序列，分别在基因两端设计上游同源臂引物SEQNO.1、SEQNO.2和下游同源臂引物SEQNO.3、SEQNO.4，通过PrimeSTARMaxDNAPolymerase酶经过PCR扩增获得trpE的上、下游同源臂；

②将上、下游同源臂与经过线性化载体pKSVT(T2)通过solutionI混合连接酶连接获得敲除载体，化转入E.coliEC135中，提质粒再化转入E.coliEC135pM.Bam进行甲基化修饰，涂布含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板37℃、12h，挑取转化子于5mL的LB试管中，37℃、220r/min培养至OD₆₀₀为0.2时，加入质量终浓度为0.2％的阿拉伯糖进行诱导，30℃、220r/min培养12h，提取质粒电转化入地衣芽孢杆菌TCCC11148感受态，涂布含有卡那霉素的LB平板；

③将电转涂布的平板培养45℃、12h，筛选单交换的菌株划线至无抗性平板中培养37℃、12h，挑取生长菌株对点含有卡那霉素与不含抗生素的平板，筛选出在卡那霉素抗性平板不长、在无抗平板生长的菌株为双交换邻氨基苯甲酸合成酶基因trpE敲除菌株地衣芽孢杆菌TCCC11148ΔtrpE，并使用验证引物trpE1、trpE2对敲除菌株进行验证；

⑵T-预苯酸脱氢酶基因tyrA的敲除

①以地衣芽孢杆菌TCCC11148基因组为模板，根据其tyrA基因序列，分别在基因两端设计上游同源臂引物SEQNO.5、SEQNO.6和下游同源臂引物SEQNO.7、SEQNO.8，通过PrimeSTARMaxDNAPolymerase酶PCR扩增获得tyrA的上、下游同源臂；

②敲除载体的构建同⑴的步骤①，将获得的载体电转化至地衣芽孢杆菌TCCC11148ΔtrpE感受态中，涂布含有卡那霉素的LB平板；

③筛选双交换菌株方法同⑴的步骤③，筛选出双交换T-预苯酸脱氢酶基因tyrA的敲除菌株地衣芽孢杆菌TCCC11148ΔtrpEΔtyrA，并使用验证引物tyrASEQNO.11、SEQNO.12对敲除菌株进行验证；

⑶过表达乳酸脱氢酶基因ldh

①以植物乳杆菌ATCC8014基因组为模板，设计引物SEQNO.13、SEQNO.14，通过PrimeSTARMaxDNAPolymerase酶PCR扩增获得ldh片段，所述ldh片段的序列为SEQNO.15；

②经BamHI/SmaI双酶切后回收ldh片段与线性化载体pLY-3，使用solutionⅠ混合连接酶连接片段与载体；

③将重组载体pLY-3-ldh化转入E.coliEC135中，提质粒再化转入E.coliEC135pM.Bam进行甲基化修饰，涂布含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板培养37℃、12h，挑取转化子37℃、220r/min培养至OD₆₀₀为0.2时，加入质量终浓度为0.2％的阿拉伯糖进行诱导，30℃、220r/min培养12h，提取质粒电转化入地衣芽孢杆菌TCCC11148ΔtrpEΔtyrA感受态，涂布含有卡那霉素的LB平板，即得高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌；

所述苯乳酸含量的检测方法为：

利用反相高效液相色谱法快速检测苯乳酸含量，步骤如下：

⑴配置流动相A为0.05％～0.5％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.05％～0.5％三氟乙酸甲醇溶液，流动相过滤，脱气；上述百分数均为质量百分数；

⑵配置苯乳酸标品母液1mg/mL，按不同比例梯度稀释，用0.22μm无菌微孔滤膜过滤；

⑶待测样品10000～12000r/min离心5min，上清用0.22μm无菌微孔滤膜过滤，备用；

⑷使用InertSustainC184.6×250mm，5μm反相色谱柱；流动相流速：0.5～1mL/min；波长：210nm；柱温：25～30℃；进样量：5～10μL；

⑸梯度洗脱程序：0-20min10％-100％B；20-23min100％B；23-25min100％-10％B；

绘制苯乳酸标准曲线：利用AgilentOpenLab处理数据，确定苯乳酸出峰时间；以苯乳酸含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制苯乳酸标准曲线；

所述高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌经发酵后产量达17.8g/L。