[发明专利]一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌、生产苯乳酸的方法和应用

说明书

本发明涉及一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌，所述基因工程菌的构建方法为：通过基因工程与代谢工程技术对地衣芽孢杆菌TCCC 11148(2709)或/大肠杆菌Rosetta(DE3)进行改造，包括抑制分支酸向色氨酸途径分支、抑制预苯酸向酪氨酸途径分支、过表达苯乳酸合成酶/氨基转移酶三步分子操作。本发明通过改造地衣芽孢杆菌芳香族氨基酸代谢途径，敲除苯乳酸合成前体苯丙氨酸合成途径竞争性酶基因，过表达苯乳酸合成最直接前体酶乳酸脱氢酶基因，大大提升苯乳酸产量，为获取目标产物苯乳酸提供了新的思路。最终，获得的苯乳酸生产菌株经发酵后产量达17.8g/L，在苯乳酸的工业化生产中具有一定潜力。

技术领域

本发明属于基因技术领域，尤其是一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌、生产苯乳酸的方法和应用。

背景技术

苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)，也称为2-羟基-3-苯基丙酸，分子式为C₉H₁₀O₃。在天然环境中，苯乳酸多产于蜂蜜与奶酪中，制备后为浅黄色粉末，是一种具有优秀溶解度的小分子物质。现有技术合成苯乳酸主要是化学合成方法与生物合成方法，生物合成可以由多种微生物代谢获得，其中最主要的是通过乳酸菌发酵产生。苯乳酸因其具有抑菌谱广、稳定性高、亲水性强等多种优点，而被广泛应用于食品药品防腐剂中，作为饲料添加剂也可替代家畜饲料中的抗生素，具有较好的工业应用前景。

苯乳酸的化学制备方法是利用水解、开环、结晶等过程合成获得目的产物，因为其存在着合成步骤繁杂、特异性差、副产物较多、分离纯化困难、耗能大、产生的污染物较多等问题，所以近几年的研究主要围绕微生物发酵和全细胞催化等生物合成技术生产苯乳酸。微生物发酵法主要是通过接种产苯乳酸菌株至液体培养基中，经过长时间发酵获得的目标代谢产物。

目前苯乳酸生产菌株的筛选主要是通过天然菌株的筛选与诱变获得的，但是单纯的筛选产苯乳酸野生型菌株发酵时间较长，发酵液产物分离复杂，诱变率低下，发酵产率低难以满足工业生产需求。

全细胞催化技术是将合成苯乳酸相关酶基因在目标菌株中进行异源表达，通过添加前体物质来合成目标产物。此法相较于传统的酶催化法，为酶提供了更为安全稳定的细胞内环境，可简单快速获得目标产物。

目前所使用的全细胞催化宿主菌株大多数以遗传背景简单、实验操作便利的大肠杆菌为主。但是大肠杆菌存在一定生物安全性的问题，大肠杆菌数值为日常饮用水、食品安全等检测的重要指标之一，所以一旦在前期培养中操作失误污染环境，可能会造成工业上的巨大损失。

其次全细胞催化方法大多需要添加前体物质来催化目标产物的生成，而苯乳酸的前体物质苯丙氨酸、苯丙酮酸售价较高，相比目标产物价格利润值偏低，不适合工业大范围生产。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌、生产苯乳酸的方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌，所述基因工程菌的构建方法为：通过基因工程与代谢工程技术对地衣芽孢杆菌TCCC 11148(2709)或/大肠杆菌Rosetta(DE3)进行改造，包括抑制分支酸向色氨酸途径分支、抑制预苯酸向酪氨酸途径分支、过表达苯乳酸合成酶/氨基转移酶三步分子操作。

而且，所述基因工程菌的构建方法的步骤如下：

⑴以地衣芽孢杆菌TCCC 11148为出发菌株，敲除色氨酸合成途径中的邻氨基苯甲酸合成酶基因trpE；

⑵对地衣芽孢杆菌TCCC 11148ΔtrpE进行敲除酪氨酸合成途径中的T-预苯酸脱氢酶基因tyrA；