[发明专利]一种构建人源TCRβ的CDR3区高通量测序文库的引物组及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种构建人源TCRβ的CDR3区高通量测序文库的引物组及其应用，尤其涉及一种构建人TCRβ的CDR3区高通量测序文库的所需的引物组与文库制备方法。本发明提供的引物组可以用于全面、高效、便捷、高灵敏度的TCR检测和分析方法中，具有以下特点：对各类样本的高度兼容性、实验操作流程高度标准化和自动化、简便快捷的分析流程。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种构建人源TCRβ的CDR3区高通量测序文库的引物组及其应用，尤其涉及一种构建人TCRβ的CDR3区高通量测序文库所需的引物组以及该文库的制备方法。

背景技术

淋巴细胞通过其表面抗体识别特异性抗原来发挥免疫功能。其对抗原识别的特异性体现在克隆水平，即同一克隆的淋巴细胞能识别具有相同的抗原受体，识别同一抗原表位。T细胞抗原受体(TCR)是T细胞特异识别和结合抗原肽-MHC分子的结构，T细胞受体是异源二聚体，由两个不同的亚基所构成。95％的T细胞的受体由α亚基和β亚基构成，另外5％的受体由γ亚基和δ亚基构成，其比例会因为个体发育或疾病而变化。

TRB是编码TCRβ的基因座，其包含可变段(V)、多变段(D)、连接段(J)和恒定区(C)4个基因片段，而V、D、J、C又分为若干等位基因，T细胞发育过程中TRB基因座内发生基因重组，为TCRβ的多样性提供了分子基础，另外通过在基因重组位点附近的碱基的随机插入和缺失等机制，最终产生了多样性的TCR，以满足机体识别多种多样的抗原的需要。

TCRβ的CDR3区由V基因片段末端、D基因片段、J基因片段前端及V、D、J之间插入的核苷酸序列组成。TCRβ链按等位排斥的方式优先于TCRα链的重排，能较好的反应T细胞的TCR特征。此外，TCR的每个亚基的可变区都包含三个高度易变的互补决定区(complementarity determining regions，CDR)，最重要的CDR3负责直接与MHC所呈递的多肽结合，而且序列高度可变，故TCR的多样性主要由CDR3决定。通过对TCRβ的CDR3区进行测序，可以评价免疫组库中TCRβ的多样性等参数，进一步可以分析免疫系统的应答发生机制及过程。因此，对抗原特异性T细胞受体的鉴定往往也集中于对β链CDR3编码序列的检测。

T细胞介导的细胞免疫属于适应性免疫的一种，是免疫系统对病原体和肿瘤细胞进行识别和清除的重要途径。通过增强T细胞介导的适应性免疫反应，修复机体免疫监视、防御和调控功能的过继T细胞(Adoptive Celltransfer Therapy，ACT)疗法克服了传统治疗技术的局限性。ACT疗法包括肿瘤浸润T细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL)疗法、CAR-T细胞疗法、和TCR-T(T cell receptor-gene engineered T cells)疗法。TCR-T疗法是当前ACT领域最新技术，是通过基因工程的手段，直接改造T细胞识别肿瘤抗原的表面受体TCR，从而加强T细胞识别和杀伤肿瘤细胞的能力，受到广泛的关注并成为研究热点，在已进行的临床试验中，被证实具有良好的疗效，研究成果被Science、Nature等顶级杂志争相报道。这种疗法对传染性疾病和特定病毒的治疗潜力目前也已有研究展开探索。比如HIV、HBV和COVID-19，均可以成为TCR-T的靶点，作为创新性疗法应用于传染病的治疗和控制。以HBV感染为例，目前的抗病毒治疗仅仅是抑制病毒复制，治愈的患者不到5％。用抗病毒药物和CAR/TCR-T细胞联合治疗这些患者可能是一个可行的选择。Tan及其研究团队使用mRNA电穿孔对CAR/TCR-T细胞进行基因改造的方法将它们的功能活性限制在短时间内，因此提供了增强的安全特性，适合在慢性病毒性疾病患者中使用(Gastroenterologym,2019,156(6):1862-1876)。抗原特异性TCR的鉴定，是TCR-T疗法及药物开发最为关键的步骤，高通量抗原特异性TCR鉴定的方法，将大大缩短TCR-T疗法的开放周期，降低成本。