[发明专利]一种D-核糖-5-磷酸的制备方法和应用

权利要求书

1.一种D-核糖-5-磷酸的制备方法，其包括使用核糖激酶，将D-核糖和磷酸供体进行磷酸化反应制得所述D-核糖-5-磷酸，其特征在于，所述核糖激酶的氨基酸序列如NCBI登录号为WP_054396858.1、CCX07771.1、WP_125988536.1和/或WP_160803741.1所示的D-核糖激酶；优选地，编码所述核糖激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4所示。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述D-核糖的浓度为10g/L～100g/L，例如40g/L。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸供体与所述D-核糖的摩尔比为1:1000～5:1，例如1.5:1；和/或，所述核糖激酶与所述D-核糖的质量比为1:200～1:10；优选地，所述的磷酸供体为ATP或ATP钠盐。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸化反应的pH为6.0～8.0，例如为7.0～7.5；和/或，所述磷酸化反应的温度为25～40℃，例如为35℃。

5.如权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括进行磷酸供体再生的步骤：利用磷酸转移酶和磷酸原料将失去磷酸基团的磷酸供体的产物磷酸化为磷酸供体；

优选地，所述磷酸原料与D-核糖的摩尔比为1:1～2:1；和/或，所述磷酸供体的产物为ADP或ADP钠盐。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸供体为ATP，和/或，所述磷酸原料为磷酸化合物，例如为乙酰磷酸二钠、乙酰磷酸二钾和/或乙酰磷酸二铵；

优选地，所述磷酸化合物与所述D-核糖的摩尔比为1:1，和/或，所述磷酸转移酶与所述磷酸化合物的质量比为1:500～1:50，例如为1:163；和/或，所述磷酸供体再生的反应温度为20～40℃，例如为35℃；和/或，所述磷酸供体再生的反应pH值为6～8，例如为7.4。

7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸转移酶为NCBI登录号为AAC75356.1的乙酸激酶；优选地，编码所述乙酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

8.如权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述核糖激酶的制备包括以下步骤：

(1)将含有所述核糖激酶基因的工程菌培养至OD600为0.5～1.0优选0.8，25℃诱导优选用终浓度为0.1mM的IPTG诱导并培养12～24小时，优选16小时；

(2)收集菌体并以1:(5～20)例如1:10的重量体积比重悬至缓冲液，破碎后得到粗酶液；优选地，所述粗酶液经纯化，例如用NiBestaroseHP树脂纯化，和/或，所述缓冲液为50mMpH 7.5的Tris-HCl或PBS缓冲液；其中所述重量体积比为g:mL。

9.一种核糖激酶在制备D-核糖-5-磷酸或β-烟酰胺单核苷酸中的用途，其中，所述核糖激酶为NCBI登录号为WP_054396858.1、CCX07771.1、WP_125988536.1和/或WP_160803741.1的D-核糖激酶；优选地编码所述核糖激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4所示。

10.一种酶组合物，其特征在于，所述酶组合物包括：

1)氨基酸序列如NCBI登录号为WP_054396858.1、CCX07771.1、WP_125988536.1和WP_160803741.1所示的D-核糖激酶的至少两种；或者，

2)D-核糖激酶和磷酸转移酶；其中，所述D-核糖激酶为氨基酸序列如NCBI登录号为WP_054396858.1、CCX07771.1、WP_125988536.1和/或WP_160803741.1所示的D-核糖激酶，所述磷酸转移酶为氨基酸序列如NCBI登录号AAC75356.1所示的乙酸激酶；

优选地，编码所述烟酰胺核糖核苷激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4所示；和/或，编码所述乙酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。