[发明专利]一种D-核糖-5-磷酸的制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种D‑核糖‑5‑磷酸的制备方法，其包括使用核糖激酶，将D‑核糖和磷酸供体进行磷酸化反应制得所述D‑核糖‑5‑磷酸，所述核糖激酶的氨基酸序列如NCBI登录号为WP_054396858.1、CCX07771.1、WP_125988536.1和/或WP_160803741.1所示的D‑核糖激酶。还公开了一种酶组合物，其内容见下文。本发明的D‑核糖激酶稳定性和酶活高，利用其制备D‑核糖5‑磷酸具有工艺操作简单、适用于更高的底物浓度、转化率高、生产效率高的优点。

技术领域

本发明涉及生物催化领域，具体涉及一种D-核糖-5-磷酸的制备方法和应用。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononuclotide，β-NMN或NMN)是NAD⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又称辅酶1)最直接的前体，NAD⁺是参与细胞新陈代谢、氧化还原、蛋白质转录等上千种重要生理反应的重要活性物。由于NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。但随着对NAD⁺前体小分子物质β-NMN的研究发现，食用β-NMN可以有效提升体内NAD⁺的含量升高，并显著抑制衰老引起的新陈代谢，使得β-NMN成为了“不老神药”，在功能性保健食品方面有着很大的开发潜力和市场前景。目前NMN在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以NMN为主要成份开发出多种保健品，如美国HERBALmax、基因港GeneHarbor NMN9000、日本MIRAI LAB NMN3000胶囊、澳大利亚synext等。

生物酶法制备NMN的其中一条路线是以D-核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶等的作用下，经过三步催化反应得到NMN。如CN110373397A公开了在市售的核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶，以及烟酰胺核糖激酶突变体(R189H/S232T/R302K)催化下制得NMN。CN111051520A中公开了在ScRbk、BsPrs、HdNampt和DrPpk共同催化下制得NMN，反应48小时生成3.6mM的NMN，其中ScRbk为来源于酿酒酵母(NCBI登录号为P25332)的Rbk(Ribokinase)，但是NMN的产量仍然需要提高。

三步反应中其中重要的第一步是D-核糖在核糖激酶的作用下得到D-核糖-5-磷酸，因此需要开发一种能够高效地催化D-核糖为D-核糖-5-磷酸的高活性核糖激酶。

发明内容

为解决现有的β-烟酰胺单核苷酸生产工艺无法实现保持高转化率的同时提高原料浓度，从而生产效率低下的缺陷的技术问题，本发明提供了一种D-核糖-5-磷酸的制备方法和应用。本发明的发明人通过筛选，意外发现了四种催化能力强的核糖激酶，能够催化底物D-核糖和磷酸供体例如三磷酸腺苷二钠盐制得D-核糖-5-磷酸。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：提供一种D-核糖-5-磷酸的制备方法，其包括使用核糖激酶，将D-核糖和磷酸供体进行磷酸化反应制得所述D-核糖-5-磷酸，其特征在于，所述核糖激酶的氨基酸序列如NCBI登录号为WP_054396858.1、CCX07771.1、WP_125988536.1和/或WP_160803741.1所示的D-核糖激酶。

优选地，编码所述核糖激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4所示。

在优选的实施例中，所述D-核糖的浓度为10g/L～100g/L，例如40g/L。

优选地，所述磷酸供体与所述D-核糖的摩尔比为1:1000～5:1，例如1.5:1；和/或，所述核糖激酶与所述D-核糖的质量比为1:200～1:10。所述的磷酸供体优选为ATP或ATP钠盐。

更优选地，所述磷酸化反应的pH为6.0～8.0，例如7.0～7.5；和/或，所述磷酸化反应的温度为25～40℃，例如35℃。