[发明专利]一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法在审
| 申请号： | 202010833683.4 | 申请日： | 2020-08-18 |
| 公开（公告）号： | CN114075586A | 公开（公告）日： | 2022-02-22 |
| 发明（设计）人： | 冯庆梅;焦琦;王舒;田振华;程占冰 | 申请（专利权）人： | 弈柯莱生物科技（上海）股份有限公司 |
| 主分类号： | C12P19/30 | 分类号： | C12P19/30;C12N9/10;C12N9/12;C12N9/14 |
| 代理公司： | 上海弼兴律师事务所 31283 | 代理人： | 王卫彬;黄益澍 |
| 地址： | 200241 上海市*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 烟酰胺单 核苷酸 制备 方法 | ||
1.一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其包括使用烟酰胺磷酸核糖转移酶，将5-磷酸核糖-1-焦磷酸和烟酰胺进行磷酸化反应制得所述β-烟酰胺单核苷酸；其中所述烟酰胺磷酸核糖转移酶为氨基酸序列如NCBI登录号为WP_058739098.1、WP_011954786.1、NP_932427.1和/或WP_067153313.1所示的烟酰胺磷酸核糖转移酶；优选地，编码所述烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-4所示。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述5-磷酸核糖-1-焦磷酸的浓度为10g/L～100g/L，例如20g/L、40g/L。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶与5-磷酸核糖-1-焦磷酸的质量比为1:40～1:2。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述烟酰胺与5-磷酸核糖-1-焦磷酸的摩尔浓度比为10:1～0.5:1，例如1:1、2:1、4:1。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸化反应的pH为5.5-8.0，优选6.0～6.5；和/或，所述磷酸化反应的温度为25～40℃，优选30-35℃。
6.如权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括使用焦磷酸酶，例如氨基酸序列如NCBI登录号为P19117.2、P00817、P37487、P38576、NP_418647和/或P95765所示的焦磷酸酶；优选地，编码所述焦磷酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:5的核苷酸序列所示，或如NCBI登录号为NC_001134.8的第257112-257975位、NC_000964.3的第4168204-4169133位、NC_006461.1的第1840559-1841086位、NC_000913.3的第4449122-4449652位或NC_009785.1的第1709713-1710648位的核苷酸所示。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述焦磷酸酶与5-磷酸核糖-1-焦磷酸的质量比为1:40～1:2，例如3:40。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶或所述焦磷酸酶的制备包括以下步骤：
(1)将含有所述烟酰胺磷酸核糖转移酶或焦磷酸酶基因的工程菌培养至OD600为0.5～1.0优选0.8，25℃诱导优选用终浓度为0.1mM的IPTG诱导并培养12～24小时，优选16小时；
(2)收集菌体并以1:(5～10)的重量体积比重悬至缓冲液，破碎后得到粗酶液，所述重量体积比为g:mL；优选地，所述粗酶液经纯化，例如用NiBestaroseHP树脂纯化，和/或，所述缓冲液为50mM pH 7.5的Tris-HCl或PBS缓冲液。
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