[发明专利]一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法

说明书

本发明提供一种β‑烟酰胺单核苷酸的制备方法，其包括使用烟酰胺磷酸核糖转移酶，将5‑磷酸核糖‑1‑焦磷酸和烟酰胺进行磷酸化反应制得所述β‑烟酰胺单核苷酸；其中所述烟酰胺磷酸核糖转移酶为氨基酸序列如NCBI登录号为WP_058739098.1、WP_011954786.1、NP_932427.1和/或WP_067153313.1所示的烟酰胺磷酸核糖转移酶。本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活高，利用其制备β‑烟酰胺单核苷酸具有工艺操作简单、适用于更高的底物浓度、转化率高、生产效率高的优点。

技术领域

本发明涉及生物催化领域，具体涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，尤其是生物催化制备方法。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononuclotide，β-NMN或NMN)是NAD⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又称辅酶1)最直接的前体，NAD⁺是参与细胞新陈代谢、氧化还原、蛋白质转录等上千种重要生理反应的重要活性物。由于NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。但随着对NAD⁺前体小分子物质β-NMN的研究发现，食用β-NMN可以有效提升体内NAD⁺的含量升高，并显著抑制衰老引起的新陈代谢，使得β-NMN成为了“不老神药”，在功能性保健食品方面有着很大的开发潜力和市场前景。目前NMN在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以NMN为主要成份开发出多种保健品，如美国HERBALmax、基因港GeneHarbor NMN9000、日本MIRAI LAB NMN3000胶囊、澳大利亚synext等。

生物酶法制备NMN的其中一条路线是以D-核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶等的作用下，经过三步催化反应得到NMN。其中涉及到第三步反应为5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT)的催化下生成NMN的反应。US10519429中公开了GenBank登录号为CP001743.1的野生型NAMPT酶的多个突变体较之野生型酶活提高1.2-6.9倍，其中酶活最高的突变体为E231Q/D298A/D338E/D377E。但是底物浓度低，且NMN产率也并不高。因此仍然需要开发更高活性的NAMPT酶用于NMN的生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为克服现有的烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活不高、β-烟酰胺单核苷酸产率低等问题，提供了一种高效制备β-烟酰胺单核苷酸的方法。本发明的发明人通过筛选，意外发现了四种催化能力强的烟酰胺磷酸核糖转移酶，通过催化5-磷酸核糖-1-焦磷酸生产β-烟酰胺单核苷酸，其β-烟酰胺单核苷酸产率可以达到60％以上，催化底物浓度可达40g/L以上，催化效率高，能够用于工业化大生产。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：提供一种β-烟酰胺单核苷酸(NMN)的制备方法，其包括使用烟酰胺磷酸核糖转移酶，将5-磷酸核糖-1-焦磷酸和烟酰胺进行磷酸化反应制得所述β-烟酰胺单核苷酸；其中所述烟酰胺磷酸核糖转移酶为氨基酸序列如NCBI登录号为WP_058739098.1、WP_011954786.1、NP_932427.1和/或WP_067153313.1所示的烟酰胺磷酸核糖转移酶。

优选地，编码所述烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-4所示。

在优选的具体实施例中，所述5-磷酸核糖-1-焦磷酸的浓度为10g/L～100g/L，例如20g/L、40g/L。

在更优选的具体实施例中，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶与5-磷酸核糖-1-焦磷酸的用量的质量比为1:40～1:2。

在更优选的具体实施例中，其中，所述烟酰胺与5-磷酸核糖-1-焦磷酸的摩尔浓度比为10:1～0.5:1，例如1:1、2:1、4:1。