[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒染色方法及其应用

说明书

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒染色的方法及其应用，该方法包括如下步骤：(1)将染色剂与猪流行性腹泻病毒液混匀，避光孵育得到染色病毒液；(2)吸附柱离心法去除过量的染色剂；(3)将染色的猪流行性腹泻病毒液避光‑70℃冷冻保存。本方法可对猪流行性腹泻病毒染色；染色后的猪流行性腹泻病毒保持正常感染活性，正常感染宿主细胞，通过荧光可示踪病毒感染情况，可促进该病毒相关研究。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种利用化学染料对猪流行性腹泻病毒染色的方法及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)为冠状病毒科Alpha-冠状病毒属成员，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV感染仔猪肠道上皮细胞，引发以呕吐、腹泻、脱水为主要特征的流行性腹泻疾病，造成仔猪死亡率高达80％-100％。PEDV是近年来严重制约我国养猪产业发展的重大病原之一，其造成的仔猪损失和饲养成本的增加，给我国养猪产业造成了巨大经济损失，开展其致病性研究，制定综合防控措施，对于保障我国养猪产业的健康持续发展有着重要意义。

荧光染料作为有荧光标记和识别性能的功能性染料，在分析检测、生物分子标记、临床诊断等领域发挥重要作用。荧光标记技术是病毒研究的重要手段之一,可用于观察标记病毒的理化特性和生物学活性，以及检测病毒特异性细胞毒性。在病毒侵染早期，病毒荧光标记有助于观察病毒与细胞间的相互作用，并可为病毒侵染宿主细胞后，开展宿主细胞细胞生物学和分子生物学的相关研究奠定基础。本方法利用荧光染料对PEDV进行染色，为开展该病毒的示踪研究提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒染色的方法及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种猪流行性腹泻病毒染色的方法，该方法包括如下步骤：

(1)将染色剂与猪流行性腹泻病毒液混匀，避光孵育得到染色病毒液；

(2)吸附柱离心法去除过量的染色剂；

(3)将染色的猪流行性腹泻病毒液避光-70℃冷冻保存。

作为一种优选技术方案，步骤(1)中将染色剂与猪流行性腹泻病毒液按1:8～12的体积比混合；优选的，按1:10的体积比混合。进一步优选的，所述的染色剂为DyLight Dye594染色剂。所述的猪流行性腹泻病毒液的滴度达到1×10⁵～1×10⁶TCID₅₀/ml。

进一步优选的，步骤(1)中所述避光孵育的时间为50～70分钟。

作为一种优选技术方案，步骤(2)中去除过量的染色剂的过程为：将染料去除树脂添加至含有吸附柱的离心管中，在低温条件下离心后(优选的，4℃条件下1000×g离心，离心时间为30秒，但不仅限于此)收集吸附柱并置于新的离心管中，添加步骤(1)得到的染色病毒液至吸附柱中，在低温条件下离心后(优选的，4℃条件下1000×g离心，离心时间为45秒，但不仅限于此)收集染色的猪流行性腹泻病毒液。

一种用于检测猪流行性腹泻病毒的PCR扩增引物，该引物包括正向引物和反向引物，其中，正向引物:5’-ACTAGCGACCAGCTACCAGA-3’；反向引物:5’-TCAACTCGGTTGAGCCACTC-3’。

本发明所述猪流行性腹泻病毒染色的方法的最优选技术方案包括以下步骤：

(1)将DyLight Dye 594染色剂与猪流行性腹泻病毒液(TCID₅₀＝2×10⁵/ml)按1:10的体积比混匀，室温条件下避光孵育得到染色病毒液；