[发明专利]一种肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法

说明书

本发明公开了一种肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法。包括以下步骤：1)对待检测肺肿瘤组织DNA样本进行亚硫酸盐修饰处理；2)亚硫酸盐处理后的肺肿瘤组织DNA、20％，40％，60％，80％，100％甲基化标准品DNA、SHOX2特异性PCR检测引物、SHOX2特异性探针、内参基因引物和内参基因探针进行qRT‑PCR反应；3)测量肺肿瘤组织DNA、20％，40％，60％，80％，100％甲基化标准品在SHOX2基因的的Ct值。该肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法可以精确并且有效的区分SHOX2基因的甲基化状态，合理选择特异性的引物，可以进一步增加检测的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明涉及需要对肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化进行检测的科研及临床领域，具体是一种肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法。

背景技术

DNA甲基化是一种人体内常见的表观遗传学修饰方式，其可以调控被修饰基因的表达情况，因此被认为与肿瘤的发生有密切关系。通过检测肿瘤相关基因的甲基化状态可完成对肿瘤的早期筛查，辅助诊断，治疗，预后。目前对DNA甲基化状态的检测主要是利用亚硫酸盐预处理，从而将DNA样本中的未被甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而被甲基化的胞嘧啶(C)则无法被转化而保持原始状态，随后通过PCR或者杂交芯片对其相关基因的甲基化状态进行检测。

目前通过PCR对肿瘤组织DNA中相关基因进行甲基化状态检测的方法主要为甲基化特异PCR(methylation-specific PCR，MSP)，其是一种快速，实用的甲基化分析手段。但MSP的灵敏度与特异性较差，无法对微小的DNA甲基化状态变化进行检测，从而阻碍了其在肿瘤相关基因甲基化调控方面的应用。此外基于PCR方法的甲基化荧光法检测技术，例如专利CN103732759，CN106480210A虽提高了检测的灵敏度，但均存在操作繁琐，成本高昂，并且检测周期长的缺点。

本发明提供了在肺肿瘤组织DNA中对SHOX2基因进行甲基化检测的引物，探针，以及检测方法。该方法具有灵敏度高，特异性强，重复性好，操作简单，检测快速，安全等优点，对肺癌的诊断有一定的辅助作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法，包括以下步骤：

1)对待检测肺肿瘤组织DNA样本进行亚硫酸盐修饰处理；

2)亚硫酸盐处理后的DNA、20％，40％，60％，80％，100％甲基化标准品DNA，特异性SHOX2 的PCR检测引物、SHOX2特异性探针、内参基因引物和内参基因探针进行qRT-PCR反应；

3)测量肺肿瘤组织DNA、20％，40％，60％，80％，100％甲基化标准品DNA的Ct值。

作为本发明进一步的方案：所述特异性PCR检测引物的S-M-F的核苷酸序列如SEQID NO：1所示；所述内参基因特异性PCR检测引物的A-M-F的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

作为本发明再进一步的方案：所述特异性PCR检测引物的S-M-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述内参基因特异性PCR检测引物的A-M-R的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。

作为本发明再进一步的方案：所述特异性探针的S-M-P的核苷酸序列如SEQ IDNO：5 所示；所述内参基因特异性探针的A-M-P的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示。

作为本发明再进一步的方案：所述RT-PCR反应的反应方法，包括以下步骤：

1)在95℃下保持3分钟；