[发明专利]使用珠分离高分子量DNA

说明书

本发明的名称是使用珠分离高分子量DNA。本文提供了试剂盒、组合物和方法，该试剂盒、组合物和方法用于使用至少200μm的珠从细胞裂解物中吸附DNA以可快速重现的方式分离具有期望长度的高分子量(HMW)DNA。描述了在保持珠的同时允许洗涤结合至珠的DNA并从珠上洗脱DNA的装置。该装置允许从珠上释放的DNA洗脱液离开装置而没有剪切。该装置还允许回收珠子。

技术领域

本发明涉及使用珠分离高分子量DNA。

背景技术

存在数种分析长核酸分子的方法。例如，常规地使用纳米孔测序来对长度为数十至数百的千碱基的DNA分子进行测序(参见例如，Oxford Nanopore Technologies，牛津英国)。一项纳米孔测序研究报告了超过两兆碱基(Mb)的读长长度(Payne等人，Bioinformatics.2019 35：2193-2198)。同样，PacBio平台(Pacific Bioscience，MeloPark,加利福尼亚州)能够对长度为几十的千碱基的核酸分子进行测序。其他基因组映射平台，例如基于纳米通道阵列的方法(在Lam等人，Nat.Biotechnology 2012 30：771-776中描述，由加利福尼亚州圣地亚哥的BioNano Genomics公司开发)也提供了分析长核酸分子的方法。

如上所述的长范围基因组分析方法需要纯化的高分子量(HMW)DNA作为进样。传统上，HMW基因组DNA(gDNA)是通过苯酚/氯仿提取和随后的乙醇沉淀同时将gDNA绕在玻璃棒上而从细胞中纯化出来的。

有数种从小体积样品中纯化HMW gDNA的方法。这些包括磁盘、磁珠和二氧化硅过滤器。但是，每种现有方法都有一定的缺陷。一些方法导致HMW DNA的剪切。其他方法需要多个处理步骤，因此不理想适合同时处理大量样品。随着用于HMW基因组分析的方法改进以及临床、诊断和研究样品的数量的增加，仍然需要提高HMW DNA纯化的可靠性和效率。

发明内容

此外，本文提供了一种利用组合物的方法，该组合物包括：(i)一个或多个珠，例如玻璃珠，例如1-50个珠，其中每个珠的最小尺寸为至少200微米(μm)，优选地大于200μm，例如至少1mm，例如在1mm至6mm的范围内(例如约4mm)；(ii)包括HMW DNA的DNA溶液，例如HMWDNA的中值大小为至少35千碱基(kb)，例如至少50Kb；(iii)DNA沉淀剂。在一些实施方式中，一个或多个珠基本山是圆形的并且最小尺寸对应于珠的直径。在一些实施方式中，在用于珠保持管的单个试剂盒或组合物中，珠大小可以变化，尽管在任何单个珠保持管中使用相同或紧密相似尺寸的珠可能是优选的。方法可以包括以下步骤中的至少一步：温育组合物以将DNA粘附到一个或多个珠上；从一个或多个珠上去除未结合的材料；用洗涤缓冲液洗涤一个或多个珠；将DNA从一个或多个珠上释放到洗脱缓冲液中；和将洗脱物中已释放的DNA与一个或多个珠分离。

DNA溶液可以是预纯化的HMW DNA或包括HMW DNA和大分子的复杂混合物，例如细胞裂解物。DNA溶液可以通过裂解细胞产生裂解物，离心裂解物并将上清液用作DNA溶液而产生。可选地，DNA溶液可以通过裂解细胞产生裂解物并将裂解物用作DNA溶液而产生。可选地，DNA溶液可以是通过在裂解缓冲液中以300rpm-2000rpm范围内的搅拌速率搅拌细胞而产生的裂解物。搅拌可能发生在至少37℃-56℃的温度下。搅拌速度决定了DNA溶液中所用DNA的中值长度。

方法中使用的DNA沉淀剂可以包括离液盐、群集剂(例如聚乙二醇(PEG))和/或醇(例如乙醇或异丙醇)。离液盐和/或群集剂可以以高浓度存在于DNA沉淀剂中。

未结合的材料的去除可以通过倾倒或移液来实现，其中移液利用例如大口径的移液管吸头。

可以包括使用含醇的洗涤缓冲液的洗涤步骤。洗涤步骤可以从粘附到珠的DNA中去除残留的材料。洗涤步骤可通过在含醇的洗涤缓冲液中洗涤珠，将珠倒入珠保持管中并旋转珠保持管以除去上清液而留下粘附在珠上的DNA来完成。