[发明专利]MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法

权利要求书

1.一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，包括如下步骤：

先将于添加10%胎牛血清的DMEM培养基中培养的MDCK贴壁细胞培养至细胞汇合度为80%~90%时，弃去添加10%胎牛血清的DMEM培养基，润洗后加入胰酶溶液消化5分钟~10分钟；待细胞变圆后，轻轻拍打容器底部使MDCK细胞解离，加入添加10%胎牛血清的DMEM培养基1-2 mL终止消化；

接着将收集到的MDCK细胞悬液转移至摇瓶中，加入添加10%胎牛血清的DMEM培养基并将细胞密度调整至0.8~1.5×10⁶个细胞/mL，悬浮培养，将摇床转速设定为100rpm，温度设定为37℃，CO₂浓度设定为5%；

然后，用添加10%胎牛血清的DMEM培养基对MDCK细胞进行3~4次传代，每隔48小时传代一次，每次传代后细胞密度需保持在0.8~1.5×10⁶个细胞/mL；

之后，将含MDCK细胞的培养液以1000rpm离心10分钟并弃上清液，加入化学限定培养基重悬细胞团，继续悬浮培养，并传代至少6代至MDCK细胞完全单个悬浮生长，获得在化学限定培养基中悬浮培养的MDCK细胞系，摇床转速设定为130rpm，温度设定为37℃，CO₂浓度设定为5%，所述化学限定培养基的各组分及其含量为：

基础代谢营养物为：

5000mg/L D-葡萄糖、200mg/L丙酮酸钠、15～17mg/L L-丙氨酸、285～295mg/L L-精氨酸 、35～40mg/L L-天冬酰胺、35～40mg/L L-天冬氨酸、45～50mg/L L-胱氨酸、75～80mg/L L-半胱氨酸、30～35mg/L L-谷氨酸、840～860mg/L L-谷氨酰胺、45～55mg/L甘氨酸、70～80mg/L L-组氨酸；80～90mg/L L-异亮氨酸、130～140mg/L L-亮氨酸、100～110mg/L L-赖氨酸、80～90mg/L L-甲硫氨酸、100～110mg/L L-苯丙氨酸、90～100mg/L L-脯氨酸、70～80mg/L L-丝氨酸、120～130mg/L L-苏氨酸、50～60mg/L L-色氨酸、55～65mg/L L-酪氨酸和90～100mg/L L-缬氨酸；

核苷酸为：

10～15mg/L次黄嘌呤、0.3～0.6mg/L胸苷、6～9mg/L腺苷、6～9mg/L尿苷、6～9mg/L胞苷和6～9mg/L鸟苷；

维生素为：

0.05～0.10mg/L D-生物素、4～8mg/L叶酸、4～8mg/L烟酰胺、4～8mg/L吡哆醇、3～5mg/L硫胺素、0.4～0.6mg/L核黄素、30～40mg/L氯化胆碱、5～8mg/L D-泛酸钙和30～35mg/L肌醇；

无机盐为：

20～30mg/L硝酸铁、0.3～0.6mg/L硫酸亚铁、30～50mg/L硫酸镁、320～330mg/L氯化钾、6500～7500mg/L氯化钠、65～75mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠和50～60mg/L亚硒酸钠；

1500～2000mg/L Pluronic F-68、50～70mg/L硫酸葡聚糖；

流感病毒增殖促进剂为：

3～5mg/L胆固醇、1.0～2.0mg/L DL-α-生育酚醋酸酯、0.1～0.3mg/L豆蔻酸、0.3～0.4mg/L棕榈酸、0.2～0.4mg/L硬脂酸、3000～3300mg/L氯化镁、170～180mg/L氯化钙、10～15mg/L二甲基亚砜、1.0～1.3mg/L硫酸锌、15～20mg/L硫酸铜、0.0003～0.0005mg/L硫酸锰和0.001～0.003mg/L偏钒酸铵；

其它添加物为：

20～30mg/L柠檬酸铁铵、3.0～5.0mg/L乙醇胺和1.0～2.0mg/L谷胱甘肽。