[发明专利]MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法

说明书

一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，先用含血清培养基贴壁培养MDCK细胞，再经消化后，将所得细胞悬液置入摇瓶悬浮培养，传代3～4次后，将培养液离心，并使用化学限定培养基重悬细胞团，继续悬浮培养，传代至MDCK细胞完全单个悬浮生长。本发明的驯化方法，相较于逐步降血清法更快速高效，驯化时间仅需10代左右，远高于逐步降血清方法。相较于一步驯化法更温和，不受驯化所用无血清培养基的品质限制，更具有普遍应用价值，且其所用驯化时间同样较短，与一步驯化法相当。

技术领域

本发明涉及一种用于生产生物制品的方法，尤其涉及一种驯化细胞的方法，以使其是适应悬浮培养。

背景技术

近年来，全球季节性流感疫苗的市场需求正在逐年稳步上升，众多发展中国家疫苗接种率较低的事实更是体现了季节性流感疫苗的巨大潜在市场开发前景。此外自2009年后岁无大流行流感的爆发，流感病毒依然对人类社会存在威胁。相较于传统的鸡胚生产法，用动物细胞来生产流感疫苗正在逐步成为主流生产方式。在过去十几年中，使用贴壁MDCK细胞来扩增流感病毒已取得了巨大的进展，然而该培养模式仍存在诸多的弊端，如：血清的使用会因换液导致培养工艺的复杂性以及血清批次引起的工艺稳定性问题。此外，高细胞密度培养通常受到微载体的表面积的限制，而MDCK细胞的在无血清或化学限定培养基中悬浮培养则可以解决以上弊端，使生产工艺操作简单、控制稳定、简化下游纯化操作，更易实现流感疫苗的大规模生产。在化学限定培养基中培养MDCK细胞因培养基成分明确、外源DNA含量控制而更适宜用于人用流感疫苗的生产。

获得可悬浮培养的MDCK细胞系需要进行MDCK贴壁细胞的驯化。目前常用的方法为逐步降血清法和一步驯化法。CN109929796A公开了一种通过逐步降血清法即降血清适应培养和悬浮培养驯化两个步骤获得的适应于无血清培养的悬浮MDCK细胞，驯化周期为35周。诸多案例均表明了逐步降血清法细胞驯化时间长、步骤繁琐、多出现细胞结团现象等缺陷，无法支持高密度生长。CN107460156A公开了一种通过一步驯化法获得的适应于无血清悬浮培养的MDCK细胞，但该方法通常存在较大偶然性，对驯化使用的培养基以及驯化培养条件有着较高的要求，设计合理的培养基和优化的培养条件才能够支持快速的驯化，但获得的细胞密度尚不能满足规模化生产的要求。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，将贴壁细胞驯化为单个悬浮细胞，实现细胞的悬浮培养。

本发明的另一个目的在于提供一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，提高并获得稳定的细胞的比生长速率。

本发明的再一个目的在于提供一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，提高细胞活率。

本发明的又一个目的在于提供一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，增强对流感病毒H1N1和H3N2的扩增能力，获得的病毒滴度高。

本发明所称的“MDCK”、MDCK细胞或“MDCK细胞系”具有相同的含义，包括来自自然界的野生型MDCK，也包括通过人工手段将自然界中的MDCK细胞中进行改造。比如：通过改造了细胞干扰素抗病毒应答能力，因此使得MDCK细胞系具有更高的病毒扩增能力。通过驯化得到的新型细胞系同样保留了高产特性，还对H1N1和H3N2流感病毒均有优秀的扩增能力，适用于大规模的流感疫苗生产中。

一种MDCK细胞系的悬浮培养驯化方法，包括如下步骤：

先将于含血清培养基中培养的MDCK贴壁细胞培养至细胞汇合度为80％～90％时，弃去含血清培养基，润洗(如：磷酸缓冲盐溶液，PBS)后加入胰酶溶液消化5分钟～10分钟；待细胞变圆后，轻轻拍打容器底部使MDCK细胞解离，加入含血清培养基终止消化；

接着将收集到的MDCK细胞悬液转移至摇瓶中，加入含血清培养基并将细胞密度调整至0.8～1.5×10⁶个细胞/mL，悬浮培养，将摇床转速设定为100rpm，温度设定为37℃，CO₂浓度设定为5％；