[发明专利]一种表达鸡VP2和鸡GAL-1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种表达鸡VP2和鸡GAL‑1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用。本发明通过电转含有VP2‑GAL1序列的真核表达载体，经过单克隆细胞筛选，获得表达鸡传染性法氏囊病毒VP2‑GAL1融合蛋白的重组细胞株，该细胞株可实现蛋白的无血清、大规模、稳定生产；用VP2‑GAL1蛋白与白油佐剂乳化制成疫苗免疫SPF鸡后能够产生较高的针对VP2的中和抗体，且攻毒保护率提高。本发明可以应用于鸡传染性法氏囊亚单位疫苗的开发。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能够高效表达鸡传染性法氏囊VP2和鸡GAL-1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用。

背景技术

传染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious BursalDiseaseVirus,IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBDV是目前危害世界养禽业的三大主要传染病之一，在我国被农业部列为重点防御的二类烈性传染病。IBDV对雏鸡有高度感染性，其特征是通过破坏法氏囊中的B淋巴细胞来摧毁其淋巴器官。

IBDV属于双RNA病毒，主要有5种病毒蛋白，其中VP2占病毒蛋白的51％，是主要的结构蛋白，能够诱导中和抗体产生，是主要的保护性抗原。鸡的β-防御素-1(Gallinacin-1，GAL1)是禽体内发现的一种抗菌肽，主要表达在骨髓、气管、肝脏、肺脏、法氏囊及皮肤，对大肠杆菌、白色念珠菌、沙门氏菌等有抑菌作用。

市场上IBDV疫苗有全病毒弱毒活疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗。目前，弱毒活疫苗和灭活疫苗其安全性和制造工艺仍存在不足，如弱毒疫苗存在毒力返强及不同毒株基因重配的风险；灭活疫苗存在灭活不彻底，抗原制备困难等弊端。基因工程亚单位疫苗虽具有生物安全性高，操作简单，成本低等特点，但是其免疫保护率低是制约其发展的一大因素，因此提高亚单位疫苗免疫保护率成为研发重点。真核表达系统能够进行更准确的转录后修饰，保持抗原的天然结构，提高疫苗免疫原性；免疫佐剂及免疫增强剂的使用也在提高亚单位疫苗保护率方面起到关键作用。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明设计了一种鸡传染性法氏囊病毒VP2和鸡β防御素1的融合蛋白，所述融合蛋白为VP2-GAL1融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，编码该蛋白的基因序列如SEQIDNO.1所示。并设计了能够表达该鸡传染性法氏囊VP2和鸡GAL1融合蛋白的重组CHO细胞株，该细胞株为CHO-B40-VP2-GAL1-80#株，同时本发明细胞株以CHO-B40-VP2-80#命名保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，建议分类命名为中国仓鼠卵细胞，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNo.19959。

同时本发明设计了上述重组CHO细胞株的构建方法，构建方法包括以下步骤，

(1)人工合成如SEQIDNO.1所示的基因序列VP2-GAL1，该序列含有临床分离的鸡IBDV流行毒株VP2蛋白的基因序列和鸡β-防御素-1的成熟蛋白基因GAL-1序列，两段序列间用一个短的linker连接，VP2-GAL1序列两端分别设有HindⅢ酶切位点和EcoRⅠ酶切位点；

(2)使用HindⅢ和EcoRⅠ酶切上述VP2-GAL1序列和p1020载体，回收酶切后的VP2-GAL1序列和p1020载体片段，连接、转化、克隆PCR并进行测序验证，构建p1020-VP2-GAL1表达载体；

(3)使用p1020-VP2-GAL1表达载体转染CHO-GS-KO-B40细胞株，CHO-GS-KO细胞为内源性GS等位基因敲除细胞株，通过细胞培养、单克隆筛选获得高表达VP2-GAL1融合蛋白的细胞株CHO-B40-VP2-GAL1-80#；

(4)将CHO-B40-VP2-GAL1-80#细胞株从96孔板到24孔板再到6孔板进行扩大培养，驯化3代，得到能够完全悬浮无血清培养的细胞株。