[发明专利]与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记及其检测引物、方法与应用

权利要求书

1.与西伯利亚杏开花期早晚相关的检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）提取基因组DNA：以西伯利亚杏材料为检测样品，提取基因组DNA；

（2）进行PCR扩增：以提取的西伯利亚杏DNA为模板，利用引物对Primer1- Primer 6分别进行PCR产物扩增，得到扩增产物；

（3）PCR产物回收：使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物；

（4）进行一代测序，判定西伯利亚杏开花期早晚；

在步骤（2）中：

 所述Primer1的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:1和SQE ID NO:2；

 所述Primer2的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:3和SQE ID NO:4；

 所述Primer3的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:5和SQE ID NO:6；

 所述Primer4的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:7和SQE ID NO:8；

 所述Primer5的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:9和SQE ID NO:10；

 所述Primer6的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:11和SQE ID NO:12；

 PCR产物的凝胶电泳图显示，获得含有与西伯利亚杏开花期早晚相关的片段，分别为：

若加入引物为Primer1，则得到长度为227bp的含Ps-FT-SNP1和Ps-FT-SNP2标记的西伯利亚杏F106基因组的6号染色体的片段18103605-18103831，

若加入引物为Primer2，则得到长度为158bp的含Ps-FT-SNP3标记的西伯利亚杏F106基因组的的6号染色体的片段18104056-18104213，

若加入引物为Primer3，则得到长度为198bp的含Ps-FT-SNP4标记的西伯利亚杏F106基因组的的6号染色体的片段18104977-18105174，

若加入引物为Primer4，则得到长度为219bp的含Ps-FT-SNP5标记的西伯利亚杏F106基因组的的6号染色体的片段18106219-18106437，

若加入引物为Primer5，则得到长度为240bp的含Ps-FT-SNP6标记的西伯利亚杏F106基因组的的6号染色体的片段18106550-18106789，

若加入引物为Primer6，则得到长度为387bp的含Ps-FT-SNP7标记的西伯利亚杏F106基因组的的6号染色体的片段18107035-18107421；

在步骤（4）中：

若使用Primer1进行PCR扩增，对PCR产物进行测序，Primer1检测得到的PCR产物的序列长度为227bp，若位于该序列自5’端起的第165位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP1位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第165位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP1位点的基因型为GA或AA；

若位于该序列自5’端起的第183位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP2位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第183位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP2位点的基因型为GA或AA；所述长度为227bp的序列为： TTTCACCGTACAAGCTCTGCCTGGGCGCCATGTGTCGACATCTGATACTTGTCTCTGGGAAAAGGCTAGACTATGCTAGTTGATGATGAATAAAAAAGGGATGCTTGGGCACACGAGTGGTGTCTGGGGTGGAACACAACATCGTGCGTGGCTATTGTCCCTATnGGAGACACACAGGCCAGnGCCTATGTGTTTCTCCATCGGACACGTCGGTTCTGATGCCATTT，其中n为G或A；

若使用Primer2进行PCR扩增，对PCR产物进行测序，Primer2检测得到的PCR产物的序列长度为158bp，若位于该序列自5’端起的第85位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP3位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第85位碱基为T或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP3位点的基因型为TA或AA；所述长度为158bp的序列为： AACAGACATGCATGCAGACATTGTTAAGAAAGAAAGACAATAAAAGCATAGATTTAGGCGAAGAACACGGAATCACTTTTGGATnGAGAAAAGGGTTTCTTTATACTTGGATTTTTGTTCTGTTTCAGAGCATCTCTAACTCCAAAATCCTGCTGCAG，其中n为T或A；

若使用Primer3进行PCR扩增，Primer3检测得到的PCR产物的序列长度为198bp，若位于该序列自5’端起的第74位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP4位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第74位碱基为T或G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP4位点的基因型为TG或GG；所述长度为198bp的序列为： CGCACACTCTCTCCAAAACACAAAACAATGGGAGAAATCTGAAAACTGGTTAAGCATTCCATGGTATGTGTTTnAAAAAACTTAAAGTATTGAGAGAGCAATTGACTATAAGACATTAATTCAGCCCCCATTTTGGTGTTTTAGTGAAACTCCCTTATTTTCTTGGGTTATTTTCTTGACCGTAGGGACTAATGGTGC，其中n为T或G；

若使用Primer4进行PCR扩增，Primer4检测得到的PCR产物的序列长度为219bp，若位于该序列自5’端起的第151位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP5位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第151位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP5位点的基因型为GA或AA；所述长度为219bp的序列为： GTGTTGGTGGTGTAGGCTTGGAGTTTACTGGTGGTTGGCTTCTACGAGTTCTTGGCTTAAATGGATATGTTGCTTTCTAGGACCCTTGGTGTTGGGCATGATTTTCAATGGATAGGGTTGTTGGTTGCAATCTATGTTCCCATCTCTCCAnGTAATTTTGTGGTGGGGATTTGACATTTAGGTGGTGTTAGAGCCTTCGGGCAACACTCTGACCTCTCA；其中n为G或A；

若使用Primer5进行PCR扩增，Primer5检测得到的PCR产物的序列长度为240bp，若位于该序列自5’端起的第89位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP6位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第89位碱基为T或C，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP6位点的基因型为TC或CC；所述长度为240pb的序列为： GGCTTGGCATCCGATACATGTTCATACTATGATGCCCTTCCATTAGAAGTTCGTCACGCTAAGAGGCCAATATGGATCCCCCATGGCCnGTCGAGTAAGGGTCTAGATTAAGATTCATGGAGTTGGTATTGGTACTTATGCTGGATATGCTTTGACACTCATAACACATTGTTATGTACATCGAACTATCCATGCATAGGAGTTTTTCTTTGACAGTCTTACGTTGTGGTGGGTTGTTT；其中n为T或C；

若使用Primer6进行PCR扩增，Primer6检测得到的PCR产物的序列长度为387bp，若位于该序列自5’端起的第185位碱基为C，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP7位点的基因型为CC；若位于该序列自5’端起的第185位碱基为C或T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP7位点的基因型为CT或TT；所述长度为387bp的序列为： CCAAATTGGCATGTGTCGGACTCTCTTGTTAGTCCAAGACATGTGTTGTATTCTTTCCTACCATGGGGTTTGTCCCATGTGATTTTCCTATAAAGGTTTTAATAAGGCCGTTGTTTCGTGCCCGTCTTTGTATGTCTCTTTGGATTATGAATGAAATCCTTTTCTAAAACTATCATTGACATTAnGTGCCCATTAAAACTATCAATTACTTTAGCCTTTCTAGTATAAAGAGTAGCTCAAAATATGCACTTGTAGTCATTTTAATATTATTAATGAGTAATGGAAAAGACAAATCAGCAATTAGTCTAATGTTACTTCTCTTCTTAACATTCCGTATCCTATTGGCAAACATAAGTTATAAGCTTAATCCCGAATCGCATGTCTTTG；其中n为C或T；

将步骤（4）得到的测序结果，与参考序列进行比对，判定西伯利亚杏的花期：

若Ps-FT-SNP1的基因型为GG，Ps-FT-SNP2基因型为GG，Ps-FT-SNP3的基因型为TT，Ps-FT-SNP4基因型为TT，Ps-FT-SNP5基因型为GG，Ps-FT-SNP6基因型为TT，Ps-FT-SNP7基因型为CC，则判定待测西伯利亚杏为早花；

若Ps-FT-SNP1的基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；

若Ps-FT-SNP2基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；

若Ps-FT-SNP3的基因型为TA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；

若Ps-FT-SNP4基因型为TG或GG，则判定待测西伯利亚杏为晚花；

若Ps-FT-SNP5基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；

若Ps-FT-SNP6基因型为TC或CC，则判定待测西伯利亚杏为晚花；

若Ps-FT-SNP7基因型为CT或TT，则判定待测西伯利亚杏为晚花；

所述西伯利亚杏样品为万家沟15、巴林右旗24、科右45、科左33、克什克腾22、万家沟17、山杏3号、科左38、扎鲁特08、乌拉山08或克什克腾05。

2.根据权利要求1所述的与西伯利亚杏开花期早晚相关检测方法，其特征在于，在步骤（2）中：

反应体系为25μL，包括：

12.5µL的2×Taq PCR Mix，

0.5μl的待检测DNA，

0.5μL的正向引物，浓度为10μmol/L；0.5μl的反向引物，浓度10μmol/L，

11μL的DNase/RNase-Free water；

反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃总延伸6min；最后于4℃保存。