[发明专利]用于表达荧光蛋白的肉葡萄球菌质粒及其构建方法和应用

说明书

本发明属于生物监测技术领域，具体为一种在肉葡萄球菌用于稳定表达荧光蛋白的质粒及其构建方法和应用。本发明将启动子Peftu片段、信号肽Tat片段、信号肽Sec片段和红色荧光蛋白DsRed的突变体DsRed‑Monomer片段，构建得到质粒pBT2‑E‑DsRed‑M、pBT2‑E‑Tat‑DsRed‑M和pBT2‑E‑Sec‑DsRed‑M。通过将质粒转化到肉葡萄球菌中，使其能够表达单体红色荧光蛋白。该技术可以代替传统的染料标记，对肉葡萄球菌在发酵过程动态变化、葡萄球菌在细胞侵染以及动物侵染过程中的生物行为实现实时观察动态研究，并为肉葡萄球菌在合成生物学与系统生物学等领域的应用提供依据。

技术领域

本发明属于生物监测技术领域，特别涉及一种用于荧光蛋白的肉葡萄球菌质粒及其构建方法和应用。

背景技术

葡萄球菌(Staphylococcus)是一群革兰氏阳性球菌，因常常堆聚成葡萄串状而得名，无鞭毛，不能运动，也无芽孢。肉葡萄球菌不产生任何毒素、溶血素、凝固酶或聚集因子，是目前葡萄球菌属中被完全确认的食品级GRAS(generally recognized as safe)菌株。肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)作为肉制品发酵行业中形成肉制品风味的关键菌种，在欧洲等地被用作生肉产品起始培养物已经超过60年。此外，由于肉葡萄球菌具有很低的胞外蛋白水解活性，所以肉葡萄球菌还可以用作良好的基因工程宿主菌。作为选择性的克隆宿主菌，不仅可以在分子遗传学方面用来研究葡萄球菌属相关代谢途径，而且还能用于异源蛋白的表达和分泌。

根据信号肽的结构，可将其分为分泌型(Sec)信号肽、双精氨酸转运(twin-arginine transolcation，Tat)信号肽和脂蛋白(Lip)信号肽等。Sec转运系统只能转运未折叠或部分折叠的蛋白质，而Tat转运系统可将处于正确折叠状态的蛋白质转运到细胞外，在基因工程领域中可以用于分泌无法通过Sec系统转运的外源蛋白。

DsRed-Monomer是天然四聚体DsRed的一个单体变体。它是一种28kDa的自荧光蛋白，具有宽的激发和发射带。它比天然的DSRed更快地成熟，并且pH和温度(高达37℃)是稳定的。其DNA序列含有678bp构成的开放阅读框(ORF)。基于DsRe-Monomer的标记系统的优点包括：可以灵活地将目标蛋白连接到任何一个末端，能够执行位点特异性的基因编码，以及由于其在光谱的红色区域的激发-发射，实现了比低细胞自荧光更有效的检测。目前，国内外尚无DsRed-Monomer基因在肉葡萄球菌中表达的相关报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供了在肉葡萄球菌中用于表达单体红色荧光蛋白的质粒以及能够表达荧光蛋白的启动子与信号肽。本发明的目的之二在于提供了用于表达单体红色荧光蛋白的构建方法。本发明的目的之三在于表达荧光蛋白的肉葡萄球菌质粒的应用。

本发明的技术方案如下：

用于在肉葡萄球菌中表达单体红色荧光蛋白质粒，所述载体为pBT2质粒，所述pBT2质粒的序列号为SEQ ID NO.1。

用于在肉葡萄球菌中表达单体红色荧光蛋白的质粒构建方法具体方法如下：

(1)启动子Peftu的制备

使用含KpnI酶切位点的引物Peftu-F和含BamHI酶切位点的引物Peftu-A对ufA基因的启动子Peftu片段进行扩增、回收，得到启动子Peftu片段。其中，

Peftu-F：

Peftu-R：

(2)信号肽Tat基因的制备