[发明专利]一种猪肝脏组织类器官模型及其体外构建方法

权利要求书

1.一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，将剪碎清洗后的新生仔猪肝组织转移到50mL无菌离心管中，加入10mL消化液，用封口膜封住离心管，在37℃条件下恒温振荡孵育器中以200rpm的转速进行孵育消化；其中，消化液包括无血清DMEM/F-12培养基和2.5mg/mL胶原酶D；

步骤2，1小时后，取25μL消化后的溶液在盖玻片上，显微镜拍照并用标尺测量类器官细小颗粒的大小，当大部分颗粒的直径在100-200μM范围内停止消化；若大于200μM，则每15分钟检测一次；类器官细小颗粒为单细胞群，其保留了细胞间的基质；

步骤3，完成消化后，将50mL离心管在室温下以530g的转速离心5分钟，小心去除上清，加入5mL红细胞去除液去除红细胞，重悬类器官细小颗粒，37℃孵育5分钟，在室温以530g的转速离心5分钟，小心去除上清，再加入10mL基础培养基重悬，取25μL在显微镜下计数，在室温下以530g的转速离心5分钟；

步骤4，将步骤3得到的类器官颗粒在预冷的PBS中重悬，密度调整为4×10⁴，与基质凝胶按1:1混合，以每孔1000个的密度接种在24孔板中，小心放入37℃培养箱；

步骤5，当基质凝胶凝固后，在每个孔内加入500μL诱导培养基，孵育4天，维持类器官正常生长，从第5天开始，换用扩张培养基培养，扩张培养基每3-4天更换一次，得到猪肝脏组织类器官模型。

2.根据权利要求1所述的一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法，其特征在于，所述诱导培养基，包括：B27细胞培养添加剂、N2细胞培养添加剂、N-乙酰半胱氨酸、Rspo1条件培养基、烟酰胺、重组人[Leu15]-胃泌素I、重组人EGF、重组人FGF10、重组人HGF、Forskolin、A83-01、重组人Noggin或Noggin条件培养基、Wnt3a条件培养基和Rho激酶抑制剂，其中B27细胞培养添加剂不含维生素A。

3.根据权利要求1所述的一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法，其特征在于，所述诱导培养基，包括：1:50B27细胞培养添加剂、1:100N2细胞培养添加剂、1mM N-乙酰半胱氨酸、10％(vol/vol)Rspo1条件培养基、10mM烟酰胺、10nM重组人[Leu15]-胃泌素I、50ng/ml重组人EGF、100ng/ml重组人FGF10、25ng/ml重组人HGF、10μM Forskolin、5μM A83-01、25ng/ml重组人Noggin或5％(vol/vol)Noggin条件培养基、30％(vol/vol)Wnt3a条件培养基和10μM Rho激酶抑制剂，其中，B27细胞培养添加剂不含维生素A。

4.根据权利要求1所述的一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法，其特征在于，所述扩张培养基，包括：B27细胞培养添加剂、N2细胞培养添加剂，N-乙酰半胱氨酸、Rspo1条件培养基、烟酰胺、重组人[Leu15]-胃泌素I、重组人EGF、重组人FGF10、重组人HGF、Forskolin和A83-01，其中B27细胞培养添加剂不含维生素A。

5.根据权利要求1所述的一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法，其特征在于，所述扩张培养基，包括：1:50B27细胞培养添加剂、1:100N2细胞培养添加剂、1mM N-乙酰半胱氨酸、10％(vol/vol)Rspo1条件培养基、10mM烟酰胺、10nM重组人[Leu15]-胃泌素I、50ng/ml重组人EGF、100ng/ml重组人FGF10、25ng/ml重组人HGF、10μM Forskolin和5μM A83-01，其中B27细胞培养添加剂不含维生素A。

6.根据权利要求1所述的一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法，其特征在于，新生仔猪肝组织的剪碎清洗步骤，包括：

将采集的新生仔猪的肝组织用含有5倍青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的PBS清洗液反复冲洗后剪碎，再用含有5倍青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的PBS清洗液进行离心清洗直至上清液清澈。

7.一种由权利要求1至6任一项所述方法构建的猪肝脏组织类器官模型。