[发明专利]一种猪肝脏组织类器官模型及其体外构建方法

说明书

本发明公开一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法。将新生仔猪的肝组织剪碎清洗后，加入消化液进行孵育消化，得到类器官细小颗粒；将类器官细小颗粒与基质凝胶混合后进行接种；待基质凝胶凝固后，先用诱导培养基孵育4天，然后换用扩张培养基培养，扩张培养基每3‑4天更换一次，得到猪肝脏组织类器官模型。本发明构建方法简单，构建迅速，可操作性强，直接通过新生动物类器官小颗粒构建类器官模型，不仅能够真实反映猪活体模型中的内环境，还能用于在分子细胞水平研究猪在体模型中肝脏的生长以及脂质代谢，减少对活体猪的采样。

技术领域

本发明属于动物细胞工程技术领域，涉及一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法。

背景技术

类器官（Organoids）是一种通过3D培养技术在体外构建的微器官。因其拥有真实器官的复杂三维结构以及与来源器官高度相似的生理功能，从而在生物学领域得到了广泛的应用，并逐步代替细胞系。使用细胞外基质（如基质凝胶）的独特系统使有机物更接近体内组织结构和功能特性的肝脏类器官培养正在成为原代细胞培养的一种流行的替代方法，用于在培养皿中重现组织和研究人体和小鼠的肝脏生理学和疾病发病机制。然而，这种方法虽然可以消除体外较多干扰效应，并提供体内组织的简化模型，但在大型动物中还没有很好的建立。并且，目前人源或者鼠源肝脏类器官的构建还是以肝脏单细胞构建为主，通过干细胞诱导成类器官，其存在的缺点是缺少细胞间的基质，不能完全真实地模拟体内肝脏的生理学功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法，以解决现有技术中存在的目前人源或鼠源肝脏类器官构建以肝脏单细胞构建为主，得到的类器官缺少细胞间的基质，不能真实地模拟体内肝脏生理学功能的问题。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种猪肝脏组织类器官模型的体外构建方法，包括以下步骤：

将新生仔猪的肝组织剪碎清洗后，加入消化液进行孵育消化，得到类器官细小颗粒；

将类器官细小颗粒与基质凝胶混合后进行接种；

待基质凝胶凝固后，先用诱导培养基孵育4天，然后换用扩张培养基培养，扩张培养基每3-4天更换一次，得到猪肝脏组织类器官模型。

进一步地，所述消化液，包括：无血清DMEM/F-12培养基和胶原酶D。

进一步地，所述诱导培养基，包括：B27细胞培养添加剂、N2细胞培养添加剂、N-乙酰半胱氨酸、Rspo1条件培养基、烟酰胺、重组人[Leu15]-胃泌素I、重组人EGF、重组人FGF10、重组人HGF、Forskolin、A83-01、重组人Noggin或Noggin条件培养基、Wnt3a条件培养基和Rho激酶抑制剂，其中B27细胞培养添加剂不含维生素A。

进一步地，所述诱导培养基，包括：1:50 B27细胞培养添加剂、1:100 N2细胞培养添加剂、1 mM N-乙酰半胱氨酸、10%（vol/vol）Rspo1条件培养基、10 mM烟酰胺、10 nM重组人[Leu15]-胃泌素I、50 ng/ml重组人EGF、100 ng/ml重组人FGF10、25 ng/ml重组人HGF、10μM Forskolin、5μM A83-01、25ng/ml重组人Noggin或5%（vol/vol）Noggin条件培养基、30%（vol/vol）Wnt3a条件培养基和10μM Rho激酶抑制剂，其中，B27细胞培养添加剂不含维生素A。

进一步地，所述扩张培养基，包括：B27细胞培养添加剂、N2细胞培养添加剂，N-乙酰半胱氨酸、Rspo1条件培养基、烟酰胺、重组人[Leu15]-胃泌素I、重组人EGF、重组人FGF10、重组人HGF、Forskolin和A83-01，其中B27细胞培养添加剂不含维生素A。