[发明专利]一种塞内卡病毒猪源单克隆基因工程抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种塞内卡病毒猪源单克隆基因工程抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用塞内卡病毒株感染猪，21d后用所述塞内卡病毒株制备的灭活疫苗免疫猪，免疫后21～30d采集猪外周血，分离PBMCs；

2)将所述PBMCs进行流式细胞分选，分选出IgG⁺-SVA⁺细胞；

3)以所述IgG⁺-SVA⁺细胞的基因组为模板反转录，得到单细胞cDNA；

4)将所述单细胞cDNA为模板进行巢式PCR扩增，得到猪IgG重链可变区的基因和轻链可变区的基因；

5)将所述猪IgG重链可变区的基因和轻链可变区的基因分别构建IgG重链表达载体和IgG轻链表达载体；

6)将所述IgG重链表达载体和IgG轻链表达载体共转染真核细胞进行重组表达，分离重组蛋白得到塞内卡病毒猪源单克隆基因工程抗体。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)中所述塞内卡病毒株为SVA/HN/11/2017兰兽研，保藏编号为CGMCC NO.19966；

所述SVA/HN/11/2017兰兽研的毒价为1×10⁹TCID₅₀/mL；

所述SVA/HN/11/2017兰兽研的免疫剂量为2mL/头。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)中将所述PBMCs进行流式细胞分选前，包括对所述PBMCs进行流式细胞染色；

所述流式细胞染色的方法，将PBMCs与生物素标记的SVA病毒粒子抗原和抗猪IgG-FITC荧光抗体混合孵育，洗涤后重悬，加入Anti-biotin-APC二抗冰浴，重复洗涤后重悬，得到染色的PBMCs。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤4)中猪IgG重链可变区的巢式PCR扩增引物组包括内引物对和外引物对；所述外引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示；所述内引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；

轻链可变区的巢式PCR扩增引物组包括λ轻链巢式PCR扩增引物组和κ轻链巢式PCR扩增引物组；所述λ轻链巢式PCR扩增引物组包括核苷酸序列如SEQ ID No.7的λV3外引物、核苷酸序列如SEQ ID No.8的λV2-6外上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.9的λV8外上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.10的λ外下游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.11的λV3内上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.12的λV2-6内上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.13的λV8内上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.14的λ内下游引物；

所述κ轻链巢式PCR扩增引物组包括κ轻链内引物对和κ轻链外引物对；κ轻链外引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示；所述κ轻链内引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤5)中构建IgG重链表达载体时，将氨基酸序列如SEQ ID No.19所示的信号肽插入猪IgG重链可变区的基因的5′端；

构建IgG轻链表达载体时，将氨基酸序列如SEQ ID No.20所示的信号肽插入猪IgGλ轻链可变区的基因的5′端；将氨基酸序列如SEQ ID No.21所示的信号肽插入猪IgGκ轻链可变区的基因的5′端。

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤6)中在转染时，IgG重链表达载体和轻链表达载体的拷贝数比为1:2。