[发明专利]一种脱氢表雄酮多克隆抗体及其制备方法、铂纳米花探针和脱氢表雄酮酶联免疫试剂盒

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种脱氢表雄酮多克隆抗体及其制备方法、铂纳米花探针和脱氢表雄酮酶联免疫试剂盒。本发明公开了一种脱氢表雄酮多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤1：采用碳二亚胺法将脱氢表雄酮与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫原；步骤2：使用免疫原免疫兔子，取血离心，取上清即为脱氢表雄酮多克隆抗体。该制备方法采用碳二亚胺法将脱氢表雄酮和牛血清蛋白偶联得到免疫原，通过对兔子免疫，得到效价高，特异性好的脱氢表雄酮多克隆抗体。而且，该多克隆抗体的制备方法简单，易于操作。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种脱氢表雄酮多克隆抗体及其制备方法、铂纳米花探针和脱氢表雄酮酶联免疫试剂盒。

背景技术

肾上腺皮质癌是一种罕见的具有侵袭性的来源于肾上腺皮质的肿瘤，发病率估计在每100万人中0.7～2例，占所有癌症病例的0.02％。即使手术切除，约有75％-85％患者会出现术后复发，并且预后不佳。在大多数患者中，其5年生存率低于35％。也就是说肾上腺皮质癌具有可预见性差、难根除、生存率低的特点。因此，在临床中正确、较早的识别肾上腺皮质癌显得比较重要。在临床上，CT和针吸活组织检查并不能完全确诊为肾上腺皮质癌。据相关文献报导，患有肾上腺皮质癌的患者的血清或者尿液与健康人比较，类固醇类激素分泌较多。据报导，脱氢表雄酮是肾上腺皮质癌灵敏和可信赖的生物标记物，因为当肿瘤用成像的方法还不能确定时，而脱氢表雄酮的含量会有显著的提高。因此，在临床上检测脱氢表雄酮对肾上腺皮质癌的诊断有一定的实际运用。针对脱氢表雄酮的检测，建立灵敏度高、安全、成本低的免疫分析方法用于辅助肾上腺皮质癌的诊断是十分有意义的。

多克隆抗体可以识别同一抗原的多个表位,因此在免疫检测中,可以识别更多的抗原，也比较少受到抗原构象变化的影响。因此，相比于单克隆抗体，在相同条件下，利用多克隆抗体可以提高检测的灵敏度，对一些丰度偏低的蛋白更容易检出。目前多克隆抗体的制备是利用抗原免疫实验动物，提取免疫实验动物血液中的抗体即为多克隆抗体。但这种制备方法制得的多克隆抗体效价低。

发明内容

本发明提供了一种脱氢表雄酮多克隆抗体及其制备方法、铂纳米花探针和脱氢表雄酮酶联免疫试剂盒，解决了现有的多克隆抗体的制备方法制得的多克隆抗体效价低的问题。

其具体技术方案如下：

本发明提供了一种脱氢表雄酮多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：采用碳二亚胺法将脱氢表雄酮与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫原；

步骤2：使用免疫原免疫兔子，取血离心，取上清即为脱氢表雄酮多克隆抗体。

本发明提供的多克隆抗体的制备方法为常规的针对小分子抗原的制备方法。采用碳二亚胺法将脱氢表雄酮半抗原和牛血清蛋白偶联得到免疫原，通过对兔子免疫，得到效价高(可达到256 000)，特异性好的脱氢表雄酮多克隆抗体。

本发明步骤1具体为：将脱氢表雄酮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺溶于DMF中反应，得到反应液，将反应液加入含牛血清蛋白的缓冲液中反应，纯化，离心，收集上清得到免疫原。

本发明中，脱氢表雄酮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺的摩尔比优选为0.1：0.15：0.15；

脱氢表雄酮半抗原与牛血清蛋白的用量比为(0.1-0.2)mmol：(100-200)mg，优选为0.1mmol：113mg；

所述含牛血清蛋白(BSA)的缓冲液的制备具体为：将BSA充分溶解在PBS中，得到含牛血清蛋白的PBS缓冲液，其中，PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4，BSA的浓度为28.25mg/mL；

所述纯化优选将反应得到的反应液于PBS缓冲液中透析三天，其中，PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4。