[发明专利]一种无血清细胞冻存液、制备方法及其使用方法

说明书

本发明公开了一种无血清细胞冻存液、制备方法及其使用方法，涉及生物医药技术领域。本发明无血清细胞冻存液包括如下组份：聚乙二醇4～6g/100mL，海藻糖0.5～2.5g/100mL，葡萄糖2～3g/100mL，全反式维甲酸0.5～1.5mg/100mL及少量抗坏血酸0.5mg/100ml，溶剂为无血清基础培养基，最终PH为6.8～7.4；使用方法包括消化、冻存、复苏。本发明细胞冻存液是成分明确、不含外源血清和有机溶剂，避免外源蛋白污染，同时可不采用程序降温，直接冻存于‑80℃；能有效地保护干细胞活性，维持并保证细胞冻融之后活性不丢失；本发明冻存方法，复苏时减少细胞吸水涨破的风险，保证细胞活性。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别是涉及一种无血清细胞冻存液、一种无血清细胞冻存液的制备方法以及一种无血清细胞冻存液的使用方法。

背景技术

随着生物及细胞类制剂的增多，细胞在越来越多方面应用，而细胞的存放往往限制了细胞的应用。在细胞培养过程中随着传代次数的增加，细胞的各种生物特性都会逐渐发生变化。因此原代细胞或细胞种子的及时保存就显得尤为必要。除此之外，购买、交换和运送某些细胞也需要利用细胞冻存的形式来进行。因此，及时方便地进行细胞的冻存在实际工作中显得十分必要。

目前，最成熟和最稳定的冻存细胞技术是将加有保护剂的细胞悬液置于-196℃液氮中，这样可以使细胞暂时脱离生长状态而保持细胞的特性，在需要的时候经过复苏程序，使得细胞重新生长增殖以用于实验。

关于细胞冻存损伤的现象，研究提出了两因素假说：冰晶损伤假说和溶液损伤假说。两种假说归结于“溶质损伤”和“胞内冰损伤”两大原因，现有冻存液也是基于此来设计冻存液及降温速率。因此，目前细胞冻存及复苏的基本原则普遍遵循的是慢冻快融的方式，实践证明这样可以最大限度的保存细胞活力。但是，无论采用什么方式冻存细胞，都必须加入一种或多种保护剂类物质，以避免细胞以上述两种假说中所描述的方式致使结构受到破坏而死亡。

目前，细胞冻存要取得好的效果，多采用血清、甘油或二甲基亚砜(DMSO)等作为保护剂。这些物质有些能提高细胞膜对水的通透性，在缓慢冷冻过程中可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。渗透性保护剂DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内的离子浓度、减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤程度。

分子量较大或不容易进入细胞内的非渗透性保护剂，一般在细胞外发挥作用，如海藻糖、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白(血清的主要成分)、羟乙基淀粉等。非渗透性保护剂通过稀释降低胞外电解质的浓度，减少溶质损伤，结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶的形成。

在这些保护剂中，渗透性保护剂DMSO和非渗透性保护剂的联合使用最为广泛。因为DMSO对细胞存在一定的毒性，在目前仍未发现保护效果用量受到限制，降低或者不使用DMSO，寻找其它替代物是最好的选择。但是目前，该技术领域还未发现冻存保护效果能与DMSO媲美的物质，因此，联合其它成分，形成新的配方，降低DMSO的含量就成了较为现实的选择。血清由于其动物来源的特性，会极大增加带来杂质蛋白、病毒等感染物质的可能，而且，血清来源受限，价格昂贵。因此，寻找替代血清的非渗透性保护剂也显得尤为必要。

尽管非渗透性保护剂在细胞冷冻保存过程中都能起到一定的保护作用，但是单独起到保护作用的能力还是有限的，因此，将多种保护剂进行组合，优化出一个合适的配方比例，就显得尤为必要。本发明提供了一个新型的冻存液体系，不仅可以除去对血清的使用，免除了阶段性降温的繁琐过程，而且还显著降低了DMSO的用量，从而为无血清低DMSO冻存液提供了更多的选择。

发明内容

本发明提供了一种无血清细胞冻存液、制备方法及其使用方法，解决了以上问题。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的一种无血清细胞冻存液，包括如下组份：