[发明专利]一种合成寡聚脱氧核糖核苷酸的方法和试剂盒

说明书

本发明提供了一种合成寡聚脱氧核糖核苷酸的方法和试剂盒。本发明的合成寡聚脱氧核糖核苷酸的方法，包括如下步骤：A)制备模板引物库，所述模板引物库为随机模板引物的集合，每一模板引物的3’端被磷酸化修饰；B)制备起始引物库，所述起始引物库为随机起始引物的集合，每一起始引物固定在固相载体上；C)根据待合成寡聚脱氧核糖核苷酸的序列在起始引物库中选择对应的起始引物，随后依次在模板引物库中选择对应的模板引物并进行单个碱基的延伸反应，以在起始引物的3’端合成下个碱基，直至合成完整的寡聚脱氧核糖核苷酸。本发明的方法和试剂盒能够高通量、低成本、快速地合成超长寡聚脱氧核糖核苷酸。

技术领域

本发明涉及DNA合成技术领域，尤其是涉及一种合成寡聚脱氧核糖核苷酸的方法和试剂盒。

背景技术

传统的化学法合成寡聚脱氧核糖核苷酸(即Oligo DNA)起源于20世纪四十年代末，于六十至七十年代逐渐完善，形成了今天广泛应用的固相亚磷酰胺三酯法。该方法虽经历了数十年的发展和完善，但仍然存在诸多缺点，其中包括：①一般情况下最多只能合成120bp-175bp的Oligo DNA，且随着Oligo DNA长度的增加，成本、错误率都显著增加，一般合成长度为90-120bp；②合成工序复杂，每延伸一个碱基都需要经过去封闭、活化、偶联、盖帽、氧化；③复杂的工序导致耗时长；④化学合成中需要使用多种易导致污染的化学试剂，如二甲氧基三苯甲基(DMT)等。

近几年，合成生物学的发展取得了巨大进步，合成生物学的基础是人工合成长达50000bp-16000000bp的基因组，基于传统的合成Oligo DNA方法显然需要花费巨大的时间成本、人工成本、试剂成本，这将不利于合成生物学的快速发展。因此，一种高通量、低成本、快速合成超长Oligo DNA的方法亟待发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种合成寡聚脱氧核糖核苷酸的方法和试剂盒，该方法和试剂盒能够高通量、低成本、快速地合成超长寡聚脱氧核糖核苷酸。

本发明提供一种合成寡聚脱氧核糖核苷酸的方法，包括如下步骤：

A)制备模板引物库，所述模板引物库为随机模板引物的集合，每一模板引物的3’端被磷酸化修饰；

B)制备起始引物库，所述起始引物库为随机起始引物的集合，每一起始引物固定在固相载体上；

C)根据待合成寡聚脱氧核糖核苷酸的序列在起始引物库中选择对应的起始引物，随后依次在模板引物库中选择对应的模板引物并进行单个碱基的延伸反应，以在起始引物的3’端合成下个碱基，直至合成完整的寡聚脱氧核糖核苷酸。

本发明基于二代测序中焦磷酸测序的原理以及可逆终止荧光dNTP技术，通过设计两种特殊的引物库(即上述模板引物库和起始引物库)，利用DNA聚合酶的聚合特性以及不带荧光基团的可逆终止dNTP的终止特性，开发了一种高通量、低成本、快速、低污染的合成超长Oligo DNA的方法，所述合成的超长Oligo DNA最高可达500bp，平均可达400bp。

本发明对待合成寡聚脱氧核糖核苷酸的长度不作严格限制，长度可以≤500bp，优选为200-500bp。

本发明合成方法的具体原理如下：