[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统构建TAP基因缺失的猪T2细胞的方法

说明书

本发明涉及利用CRISPR/Cas9系统构建TAP基因缺失的猪T2细胞的方法，属于动物基因工程和遗传修饰技术领域。技术方案主要包括：首先进行TAP2基因敲除，把识别TAP2的sgRNA连接到pUC57‑sgRNA载体上，转化感受态细胞，获得含有靶向识别序列的pUC57‑sgRNA质粒，通过测序筛选阳性克隆。将重组质粒pUC57‑sgRNA和Cas9质粒共转染PK15细胞。在TAP2基因敲除的细胞上利用同样的方法敲除TAP1。本发明利用CRISPR/Cas9构建TAP基因敲除的PK15细胞系，为筛选多种猪源病毒CTL表位建立细胞模型，同时为外源性抗原的TAP非依赖性递呈机制的研究建立了细胞模型。

技术领域

本发明涉及动物基因工程和遗传修饰技术领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9系统构建TAP基因缺失的猪T2细胞的方法。

背景技术

在体内，几乎所有细胞表面都会表达主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex,MHC)I类分子并向CD8+T淋巴细胞递呈抗原肽。这些抗原肽来源于蛋白酶体对内源性蛋白或细胞内病原体抗原蛋白的降解。在胞质溶胶中产生的肽需要通过抗原处理相关转运体(Transporter associated with antigen processing,TAP)转运到内质网(ER)中，并在肽转运复合物的分子伴侣如钙网蛋白、tapasin和ERp57的帮助下与MHC I重链和轻链β2m组装成pMHC复合体，经高尔基体加工后，被递呈到细胞表面，激活细胞毒杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)，起到细胞免疫作用(Belicha-Villanueva et al.,2010)。这种蛋白酶体-TAP途径被认为是经典的MHC I类分子抗原加工递呈途径(Monaco,1995)。

最近，Schuette等(Schuette and Burgdorf,2014)指出，树突状细胞等具有吞噬能力的抗原递呈细胞，其MHC I类分子除了递呈内源性的抗原肽以外，还可以递呈外源性的抗原肽。如果肽段大小合适，外源性的肽段可以直接与空载的MHC I分子结合而递呈到细胞表面，因此不需要TAP的转运。如果TAP基因缺失或将其敲除，抗原递呈细胞就可以专门递呈外源性的多肽。早先，人和小鼠均通过建立肿瘤组织模型筛选获得了TAP1和TAP2自然缺失的抗原递呈细胞系，命名为T2细胞系(Cerundolo et al.,1990；Zhou et al.,1993)。近年来，T2细胞系用来筛选MHC I类分子限制性的抗原多肽表位(Boudewijns et al.,2016；Xuet al.,2016)。

猪的MHC I类分子，也称为猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)I类分子(SLA-I)，其功能与人及其他动物MHC class I(以下称MHC I)功能一样，主要起到介导动物细胞免疫应答的作用。猪SLA-I类分子结合和递呈的病毒抗原表位已经有多个学者在研究，但均限于在体外结合实验筛选与SLA-I结合的表位(Gao et al.,2018；Zhang et al.,2011)。体外结合实验筛选猪源病毒CTL表位存在以下问题：一，SLA-I与多肽在体外的结合并不能完全保证多肽在体内具有生物学功能；二，以上研究每一次在体外筛选病毒多肽表位都涉及到蛋白表达、纯化、复性等，使表位的筛选比较费时费力。目前，急需建立一种在细胞水平上快速筛选猪源病毒CTL表位的平台。

表达猪SLA-I的细胞系目前有PK-15(猪肾细胞)和ST(猪睾丸细胞)，均为成熟的传代细胞系。其中，利用率最高的是PK-15细胞系。多项研究表明PK-15细胞系稳定表达猪SLA-I类分子。而且，多位学者已经证实，PK-15细胞系同样也表达TAP基因，并证实SLA-I类分子内源性抗原递呈与TAP相关(Deruelle et al.,2009；Feng et al.,2012)。需要指出的是，猪与人、小鼠的研究水平不同，目前还未建立肿瘤组织模型，因此无法通过筛选自然缺失TAP1和TAP2的方法建立猪源T2细胞系。然而，借助于当前最先进的基因敲除技术CRISPR/Cas9，可以建立猪源T2(swine T2,sT2)细胞系。