[发明专利]活性污泥中宏病毒组DNA的提取方法

权利要求书

1.一种活性污泥宏病毒组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取沉积的污泥，重悬于质量百分比浓度为0.8～1.5％的柠檬酸钾缓冲液中，经80～120W、15～25kHz超声混合2～5min，制得菌液；

(2)将步骤(1)制得的菌液经去除微生物杂质，制得提取液；

(3)将步骤(2)制得的提取液浓缩后，经DNaseI处理，制得去除杂质DNA的提取液；

(4)将步骤(3)制得的去除杂质DNA的提取液经去除病毒蛋白壳体，然后经提取DNA，纯化，制得宏病毒组DNA。

2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，沉积的污泥含水率不超过80％；进一步优选的，沉积的污泥为将污泥经4000～5000g离心6～8min，取沉淀制得；

优选的，所述步骤(1)中，沉积的污泥与柠檬酸钾缓冲液混合的质量体积比为1：(3～5)，单位g/ml。

3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，超声混合的温度为0℃；优选的，超声混合过程中，每隔50～70秒，翻转震荡25～35秒；优选的，超声混合条件为：100W、20kHz超声混合3min；

优选的，所述步骤(1)中，柠檬酸钾缓冲液的质量百分比浓度为1％。

4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，去除微生物杂质包括离心步骤和过滤步骤，离心步骤具体为：在4℃条件下，8000g离心20min，取上清液；过滤步骤具体为：采用孔径为0.22μm滤网过滤。

5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，浓缩为采用30kd的超滤膜浓缩；

优选的，所述步骤(3)中，DNaseI的添加量为0.05～0.20U/μl；进一步优选的，DNaseI的添加量为0.1U/μl；

优选的，所述步骤(3)中，DNaseI处理条件为：37℃孵育20min。

6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中，去除病毒蛋白壳体的步骤如下：

向去除杂质DNA的提取液中加入EDTA溶液至EDTA浓度为18～22mmol/L，然后加入SDS溶液至SDS的质量百分比浓度为0.3～0.8％，再加入蛋白酶K至浓度为40～60mg/L，在温度为52～60℃的条件下温浴45～75min，即得。

7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中，提取DNA的步骤如下：

向去除病毒蛋白壳体的溶液中加入平衡酚，混合均匀，然后经离心，取有机相；向有机相中加入氯仿-异戊醇溶液，混合均匀，然后经离心，取上清，即得。

8.如权利要求7所述的提取方法，其特征在于，所述平衡酚与去除病毒蛋白壳体的溶液的体积比为1:1；

进一步优选的，所述离心为在4℃、12000rpm条件下离心10min；

进一步优选的，所述氯仿-异戊醇溶液中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。

9.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中，纯化包括醇沉、干燥和蒸馏水溶解步骤；

进一步优选的，所述醇沉为向提取DNA步骤获得的提取液中加入10％体积的醋酸钠溶液和2倍体积冰预冷的无水乙醇，混合均匀，-20℃放置2～3h，离心，取沉淀，制得；

更优的，所述醋酸钠溶液为浓度3M的醋酸钠溶液，pH 5.4。

更优的，所述的醇沉还包括对沉淀采用体积百分比为70％冰预冷的乙醇进行洗涤的步骤。

10.如权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述干燥为采用常温风干干燥。