[发明专利]活性污泥中宏病毒组DNA的提取方法

说明书

本发明涉及一种活性污泥中宏病毒组DNA的提取方法，包括如下步骤：(1)取沉积的污泥，重悬于质量百分比浓度为0.8～1.5％的柠檬酸钾缓冲液中，经80～120W、15～25kHz超声混合2～5min，制得菌液；(2)将步骤(1)制得的菌液经去除微生物杂质，制得提取液；(3)将步骤(2)制得的提取液浓缩后，经DNaseI处理，制得去除杂质DNA的提取液；(4)将步骤(3)制得的去除杂质DNA的提取液经去除病毒蛋白壳体，然后经提取DNA，纯化，制得宏病毒组DNA。本发明所述方法不仅可有效提取出活性污泥宏病毒组DNA，还大大提高了宏病毒组DNA的得率和质量，并且操作简单、可行性强、成本低，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种活性污泥中宏病毒组DNA的提取方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

生物活性污泥法是当前生活废水、工业废水等处理的主要方式，它是一种利用悬浮生长的微生物絮体处理废水的好氧处理方法。活性污泥便是在此过程中微生物群体以及它们所依附的有机物和无机物的总称。

活性污泥中的生物群落结构复杂，其中的细菌、真菌、病毒、原生动物和后生动物与废水中的有机物形成了复杂的食物链。一些细菌和真菌可直接代谢废水中的有机物，在废水净化过程中起到关键作用。原生动物和后生动物作为细菌的捕食者起到维持群落结构稳定性的作用。病毒作为一类特殊的群体，可以感染细菌、真菌、原生动物以及后生动物，也对活性污泥群落结构的稳定性起到重要作用。

宏病毒组是在宏基因组理论的基础上，结合病毒的概念和技术兴起的新的学科分支。宏病毒组以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，用于鉴定环境中的病毒组成、发现新病毒、病毒溯源等。获得高质量的宏病毒组DNA，是对准确鉴定、分析环境中病毒群落组成等研究的必要条件。

中国专利文献CN103789300A(申请号201410067311.X)公开了一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取方法，主要通过氯化钠溶液初洗污泥，加入提取缓冲液、溶菌酶、十二烷基硫酸钠预处理，酚、氯仿异戊醇抽提，以及无水乙醇/乙酸钠沉淀宏基因组DNA等步骤，提取出环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA样品。

中国专利文献CN102703430A(申请号201210180253.2)公开了一种高质量提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，本方法包括使用超声波及涡旋震荡使普洱茶表面分离微生物；使用洗涤缓冲液对微生物进行洗涤；使用DNA提取液对微生物总DNA的粗提，对粗提DNA进行纯化的步骤。

上述方法应用于活性污泥中宏病毒组DNA的提取时，会出现细菌等宿主DNA的污染。另外，现有文献上发表的宏病毒组DNA提取方法都存在DNA条带弥散、DNA质量不高、细菌DNA污染等问题，无法获得高质量宏病毒组DNA。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提供了一种活性污泥宏病毒组DNA的提取方法。

本发明的技术方案如下：

一种活性污泥宏病毒组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取沉积的污泥，重悬于质量百分比浓度为0.8～1.5％的柠檬酸钾缓冲液中，经80～120W、15～25kHz超声混合2～5min，制得菌液；

(2)将步骤(1)制得的菌液经去除微生物杂质，制得提取液；

(3)将步骤(2)制得的提取液浓缩后，经DNaseI处理，制得去除杂质DNA的提取液；

(4)将步骤(3)制得的去除杂质DNA的提取液经去除病毒蛋白壳体，然后经提取DNA，纯化，制得宏病毒组DNA。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，沉积的污泥含水率不超过80％；进一步优选的，沉积的污泥为将污泥经4000～5000g离心6～8min，取沉淀制得。