[发明专利]一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法

权利要求书

1.一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)、通过流式细胞仪分选获得大鼠骨髓中CD45^-Lin^-CD106⁺细胞；

(2)、5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞细胞分化；

(3)、通过qRT-PCR，免疫荧光检测心肌蛋白相关基因，验证5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞细胞分化过程；

步骤(1)中，具体方法为：

分离大鼠胫骨和股骨，并清除肌肉和结缔组织，PBS冲洗出骨髓，在冲出的骨髓中加入红细胞裂解液避光放置10分钟，离心后获得总单个核细胞(TNCs)，CD45、CD106、lin单抗(1:200)室温孵育30min，流式细胞仪分选获得CD45^-Lin^-CD106⁺细胞，此为大鼠极小胚胎干细胞的表面标记。

2.根据权利要求1所述的一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征是，步骤(2)中，具体方法为：

将极小胚胎干细胞加入到含有10μM的5-氮杂胞苷的培养基中，诱导极小胚胎干细胞细胞分化，24小时后移去培养基，磷酸盐缓冲液漂洗细胞2遍，更换不含5-氮杂胞苷的完全培养基继续培养3周；用相差显微镜观察细胞每日形态变化。

3.根据权利要求2所述的一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征是，步骤(2)中，5-氮杂胞苷诱导后的细胞在第21天用一抗心肌特异性cTnT和α-actin以1:50稀释后，4℃条件下孵育过夜，二抗为PE标记的羊抗兔IgG以1：200稀释，湿盒内室温1小时；荧光显微镜下观察阳性细胞率。

4.根据权利要求3所述的一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征是，步骤(3)中，具体方法为：

RT-qPCR检测极小胚胎干细胞以及诱导后的细胞全能干细胞基因和心肌蛋白基因，从分别于诱导前、诱导第7、14、21天细胞中提取总RNA，通过逆转录合成cDNA；荧光定量PCR检测Nanog、Oct-4、Sox2、cTnT、α-actin的基因表达；PCR扩增反应体积包括2μLcDNA、10μLSYBRTaq,0.8μL上游和下游引物,0.4μL RoxII和PBS来弥补体积20μL；在不同天数提取的RNA设置3个复孔，分析各孔扩增循环数(cycle threshold，CT)，mRNA相对含量采用标化后的2－ΔΔCT值表示，计算基因初始拷贝数的相对量。