[发明专利]一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法

说明书

本发明涉及一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，包括以下步骤：（1）、通过流式细胞仪分选获得大鼠骨髓中CD45−Lin−CD106+细胞(极小胚胎干细胞)；（2）、5‑氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化；（3）、通过qRT‑PCR，免疫荧光检测心肌蛋白相关基因，验证5‑氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化过程。通过本发明，旨在从大鼠骨髓组织中分离培养出极小胚胎干细胞，并采用5‑氮杂胞苷诱导分化，观察其生物学特性及定向分化特征，以期为临床缓慢性心律失常的细胞移植治疗寻找一种方便、快速的途径。验证结果合理准确，实验过程严密周谨。

技术领域

本发明涉及一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，属于干细胞分化培养领域。

背景技术

缓慢型心律失常是包括病窦综合征、房室传导阻滞等一组威胁人们生命的疾病,其特征是心脏起搏或传导功能障碍。由体细胞基因转染、细胞融合或细胞移植构成的生物起搏器为治疗缓慢型心律失常提供了一种新的选择。单纯的基因生物起搏存在转染靶向及转染效率的不确定性，因此人们逐渐选择了细胞生物起搏治疗。虽然细胞生物起搏器拥有众多优势，但存在两个问题，1)种子细胞选择难，2)诱导方法难抉择。目前，多种干细胞(胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞)均在体外成功诱导为心肌细胞，但细胞来源不足、伦理，免疫排斥反应等问题限制了其在临床上的推广应用。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有问题，提供一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法。

本发明的目的是这样实现的，一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)、通过流式细胞仪分选获得大鼠骨髓中CD45-Lin-CD106+细胞(极小胚胎干细胞)；

(2)、5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化；

(3)、通过qRT-PCR，免疫荧光检测心肌蛋白相关基因，验证5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化过程。

步骤(1)中，具体方法为：

分离大鼠胫骨和股骨，并清除肌肉和结缔组织，PBS冲洗出骨髓，在冲出的骨髓中加入红细胞裂解液避光放置10分钟，离心后获得总单个核细胞(TNCs)，CD45、CD106、lin单抗(1:200)室温孵育30min，流式细胞仪分选获得CD45-Lin-CD106+细胞(极小胚胎干细胞)；

分选后的极小胚胎干细胞在含有10％胚牛血清的DMEM培养基中放入37℃、5％CO2培养箱培养；在极小胚胎干细胞增殖期间，每三天更换培养基，待细胞达到70％融合后进行传代培养。

步骤(2)中，具体方法为：

将极小胚胎干细胞加入到含有10μM的5-氮杂胞苷的培养基中，诱导极小胚胎干细胞分化，24小时后移去培养基，磷酸盐缓冲液漂洗细胞2遍，更换不含5-氮杂胞苷的完全培养基继续培养3周；用相差显微镜(TE2000尼康)观察细胞每日形态变化。

步骤(2)中，5-氮杂胞苷诱导后的细胞在第21天用一抗心肌特异性cTnT(Abcam)和α-actin(Abcam)(1:50稀释)4℃条件下孵育过夜，二抗(PE标记的羊抗兔IgG以1：200稀释)，湿盒内室温1小时；荧光显微镜下观察阳性细胞率。

步骤(3)中，具体方法为：