[发明专利]一种食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法

说明书

本发明公开了一种食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法。本发明公开的食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法，包括：将食用菌样品于固定液中固定，得到固定好的样品；将固定好的样品置于冷冻保护剂中进行预处理，得到预处理的样品，冷冻保护剂由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在冷冻保护剂中的浓度分别为5％(质量百分比)海藻糖和10％(体积百分比)甘油；将预处理的样品利用冷冻切片组织包埋剂进行包埋，得到包埋好的样品；将包埋好的样品进行切片，完成食用菌的超薄冷冻切片。本发明的方法可以最大程度地保证食用菌组织结构的完整性，且操作简便，处理时间短，无包埋剂残留污染，不易掉片，适用于多种食用菌子实体和菌丝体。

技术领域

本发明涉及生物组织学技术领域中，一种食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法。

背景技术

细胞显微结构观察常用的切片方法有徒手切片法、石蜡切片法和冷冻切片法等。徒手切片法不需要专门的仪器设备和特殊化学试剂(脱水剂、包埋剂等)处理，但对切片技术要求高，在制片过程中易破坏样品的组织结构。石蜡切片法步骤多、耗时长，溶蜡高温操作易引起样品染色体或其它组织结构损伤，并且石蜡自发荧光的干扰使其不适于荧光染色或其它免疫荧光染色观察。冷冻切片是利用低温使组织迅速冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。与常规的石蜡切片相比，它不经脱水、透明、浸蜡等步骤，易保持原有生活形态，具有快速、简便、易操作等优点，常用于组织化学、免疫定位及原位杂交等研究。

食用菌子实体的形成和发育机制是近年来食用菌领域的研究热点。从细胞生物学层面对子实体结构进行观察是研究子实体形成发育最为有效和直观的方法。食用菌的子实体和菌丝体较软，尤其是子实体的菌褶部分较小、易碎且含水量高，常规的冷冻切片技术无法获得效果较好的子实体切片。故，目前急需一种更好的食用菌冷冻切片方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何对食用菌进行超薄冷冻切片。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种食用菌的超薄冷冻切片方法，所述方法包括：

1)将食用菌样品于固定液中固定，得到固定好的样品；

2)将所述固定好的样品置于冷冻保护剂中进行预处理，得到预处理的样品，所述冷冻保护剂由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述冷冻保护剂中的浓度分别为5％(质量百分比)海藻糖和10％(体积百分比)甘油；

3)将所述预处理的样品利用冷冻切片组织包埋剂进行包埋，得到包埋好的样品；

4)将所述包埋好的样品进行切片，完成食用菌的超薄冷冻切片。

上述方法中，所述预处理可通过将所述固定好的样品置于所述冷冻保护剂中抽真空再室温孵育1小时完成。

上述方法中，所述固定液可由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述固定液中的浓度分别为2.5％(体积百分比)戊二醛、0.1M KH₂PO₄和0.1M Na₂HPO₄·12H₂O。

上述方法中，所述将食用菌样品于固定液中固定可通过将所述食用菌样品置于所述固定液中抽真空再4℃孵育20分钟完成。

上述方法中，步骤3)中，包埋可在-10℃下进行。

所述包埋可采用Leica冷冻切片组织包埋剂进行。

上述方法中，所述食用菌可为丝球小奥德蘑(Oudemansiella apalosarca)、平菇(Pleurotus ostreatus)或香菇(Lentinula edodes)。

上述方法中，所述食用菌样品可为丝球小奥德蘑子实体、平菇子实体、香菇子实体或香菇菌丝体。