[发明专利]一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，本研究基于tet(X)基因表达的酶能降解替加环素的功能，开发了一种使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI‑TOF MS)的方法，本发明的检测方法操作简便、快速，准确性和特异性高；相比较于传统的CIM方法，本发明所公开的方法的检测时间由原来的18～24小时大大缩短至4～5小时，同时，本发明的检测方法的准确性和特异性与CIM方法相当。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法及其应用。

背景技术

四环素类抗生素在治疗由大多数革兰氏阳性及革兰氏阴性病菌造成的感染时具有显著的治疗效果，因此在临床上具有非常重要的作用。然而，随着细菌不断的进化，一些细菌能够产生四环素修饰酶，导致许多临床使用四环素类药物治疗失败的案例出现。

替加环素是治疗耐多药(MDR)革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌引起的复杂感染的最后手段之一。近年来，在临床分离的多药耐药菌中出现零星的替加环素耐药的病例，大部分是由于核糖体保护或高表达的抗生素外排机制所致。这种耐药性影响抗生素的吸收或抗生素与靶标之间的相互作用，但不影响替加环素的浓度或活性。此外，电阻只能垂直传输，而不能水平传输。

但是，在中国，报道了在肠杆菌科和不动杆菌属中发现了一种新的质粒介导的酶促替加环素抗性机制，即tet(X)基因。tet(X3/X4)基因具有高水平的替加环素抗性，并且存在于可转移质粒上，可以在不同菌株和物种之间水平转移抗性。tet(X3/X4)基因通过表达产生的酶可直接失活、钝化所有四环素类抗生素，包括替加环素和美国FDA新批准的依拉瓦环素、奥玛环素等，通过在碳11a位置的羟基化作用，威胁整个四环素类抗生素家族的临床疗效。更令人担心的是，在不同的生态位，包括家畜(猪、牛和鸡)、环境(农田、土壤和灰尘)和临床样本中，均发现了质粒携带的tet(X3/X4)基因。因此，急需一种快速的tet(X)基因检测方法来监测和控制质粒介导的替加环素耐药性的传播。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术对于tet(X)基因检测方法存在的检测时间长，检测灵敏度低的缺陷。

本发明的首要目的是提供一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法。

本发明的第二个目的是提供上述方法在筛选含tet(X)基因的菌株中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，包括以下步骤：

(1)配制含抗生素的标准溶液，将其与待测菌株样品的菌苔混匀、孵育3～5h，孵育后离心；

(2)取离心上清液点靶，晾干后加入基质覆盖；

(3)设置MALDI-TOF MS参数：质谱范围1m/z～1000m/z，离子源20kV，线性反射器2.62kV，镜头6kV，激光频率50Hz，脉冲离子萃取延迟114ns；

(4)结果判定：若样品出现602m/z产物峰，判定该待检测菌株携带tet(X)基因；若样品未出现602m/z产物峰，判定该待检测菌株不携带tet(X)基因。

优选的，所述抗生素为替加环素。

当选用替加环素时，步骤(1)标准溶液用0.5％NaCl溶液配制，浓度为50μg/ml。

优选的，步骤(1)孵育的条件为：37℃、转速250rpm。

优选的，步骤(1)混匀的操作为：取500ul标准溶液与一接种环的待测菌株的菌苔涡旋混匀。

优选的，步骤(1)离心的条件为：13000rpm，离心2min。