[发明专利]一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法

权利要求书

1.一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)清理

胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用清洗液冲洗胎盘表面，清洗去除残留的血液与其他杂物；

2)处理

将清洗后的胎盘组织，以脐带根部为交叉中心剪十字切口，轻轻剥离羊膜层，将脐带和羊膜分离后，钝性分离羊膜和绒毛膜；将剥离的羊膜置于含双抗的磷酸盐缓冲液中反复冲洗去除血块；

3)培养

将整块羊膜平铺于平皿内，待水分慢慢挥发，用无菌组织剪将绒毛膜组织剪碎成大小1～3cm³，将所述组织块平铺于细胞培养皿中，静止20～30分钟后，加入含有10～20％胎牛血清的培养液中进行培养；

4)接种传代

所述羊膜组织原代分离培养间充质干细胞生长达到80～90％融合后，即可传代扩增培养，获得羊膜间充质干细胞，用0.25％胰酶/EDTA消化细胞，按5000～7000个/cm3接种，接种后4～5天可以达到95％融合，融合95％以上所述间充质干细胞可以扩增至20代次以上。

2.如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：所述步骤1)中的清洗液采用包含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的磷酸盐缓冲液和生理盐水。

3.如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：所述步骤2)中的磷酸盐缓冲液采用包含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的磷酸盐缓冲液。

4.如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：步骤3)中所述10～20％胎牛血清的培养液中含有含核糖核苷的α-MEM基础培养液与胎牛血清。

5.如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：所述步骤3)中细胞培养皿中细胞培养3天后更换一次10～20％胎牛血清的培养液，之后每间隔2～3天更换10～20％胎牛血清的培养液，贴壁4～5天后即可见羊膜间充质干细胞从所述组织块中爬出，7～10天后羊膜间充质干细胞可以达到80～90％融合。

6.如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：所述步骤3)中的含有10～20％胎牛血清的培养液用量为20～50ml/皿。

7.如权利要求1所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：还包括将步骤4)中获得的间充质干细胞进行质量评估，所述质量评估包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物、分化功能、细菌检测、支原体检测、安全性评估。

8.如权利要求1至7任意一项所述的羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法其特征在于：采用所述方法建立的羊膜间充质干细胞生产规范、质量控制体系及评估体系，可以快速简便的获得临床研究与应用的间充质干细胞。