[发明专利]一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法在审

专利信息
申请号: 202010863160.4 申请日: 2020-08-25
公开(公告)号: CN111979189A 公开(公告)日: 2020-11-24
发明(设计)人: 孟明耀;侯宗柳;李琳;刘红岩;李健峰;李磊;顾玉琪 申请(专利权)人: 江苏赛亿细胞技术研究院有限公司
主分类号: C12N5/0775 分类号: C12N5/0775
代理公司: 昆明合众智信知识产权事务所 53113 代理人: 张玺
地址: 211500 江苏省南京市*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 一种 羊膜 间充质 干细胞 分离 培养 扩增 方法
【说明书】:

发明公开了一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法,1)清理,2)处理,3)培养,4)接种传代,本发明采用的组织块分离法获得的羊膜间充质干细胞方法简单,成本低,细胞活性好,纯度高,最终收获细胞浓度高,培养时间短,培养第4~5天即可看到细胞从组织块爬出,整个干细胞分离制备培养工艺能够快速、高效从羊膜组织获取高纯度的间充质干细胞。

技术领域

本发明涉及干细胞分离培养技术领域,尤其涉及一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体,是动物有机体和各种组织器官的起源细胞。新近的研究表明,众多成体组织中(如骨髓、肌肉、胃肠道、皮肤、视网膜、外周及中枢神经系统等)均存在间充质干细胞。MSCs它来源广泛、易体外分离扩增,具有向三种胚层细胞分化的多向分化潜能;具有低免疫原性、不能刺激产生同种异体免疫反应、不被细胞毒性T细胞和NK细胞杀伤,“归巢”修复作用,肿瘤趋向性以及免疫调节作用。

胎盘组织中MSCs主要分布在羊膜和绒毛膜等来源于胎儿的组织中,羊膜是胎膜最内层的一层薄膜,位于胎盘的婴儿面,由立方形或是圆柱形上皮样细胞组成其基底层,其中分布间质细胞,故羊膜干细胞主要由羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞组成。羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞相似,具有很强的可塑性和多向分化潜能,在不同的诱导培养条件下可以向三个胚层分化。羊膜间充质干细胞具有低免疫原性和免疫抑制作用,并能分泌多种细胞因子对损伤细胞进行修复,故羊膜间充质细胞是目前干细胞治疗、组织修复和再生医学的理想细胞。对羊膜间充质干细胞分离培养方法的探索及对其细胞生物学特性研究具有重要意义,可为将来的细胞移植应用奠定基础。目前分离羊膜间充质干细胞通常也采用两种方法,组织块直接贴壁法与酶消化。

酶消化分离的经济成本高,消化时间长,一般需要4~6个小时,最长的有消化16小时,组织块大小同时也会影响细胞的消化效果,如消化不充分,无法得到足够数量的细胞,而消化时间过长,其消化酶对细胞的损伤太大,细胞会大量死亡。组织块培养法原代培养方案操作简便易行,在缩短操作时间、降低成本、细胞得率高等方面具有明显优势。

发明内容

本发明的提供一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法。

本发明采用的技术方案是:

一种羊膜间充质干细胞分离培养扩增方法,包括下列步骤:

1)清理

胎儿成功分娩后,无菌条件下获取胎盘组织,用清洗液冲洗胎盘表面,清洗去除残留的血液与其他杂物;

2)处理

将清洗后的胎盘组织,以脐带根部为交叉中心剪十字切口,轻轻剥离羊膜层,将脐带和羊膜分离后,钝性分离羊膜和绒毛膜;将剥离的羊膜置于含双抗的磷酸盐缓冲液中反复冲洗去除血块;此操作方法较简单,节约时间;

3)培养

将整块羊膜平铺于平皿内,待水分慢慢挥发,用无菌组织剪将绒毛膜组织剪碎成大小1~3cm3,将所述组织块平铺于细胞培养皿中,静止20~30分钟后,加入含有10~20%胎牛血清的培养液中进行培养;

4)接种传代

所述羊膜组织原代分离培养间充质干细胞生长达到80~90%融合后,即可传代扩增培养,获得羊膜间充质干细胞,用0.25%胰酶/EDTA消化细胞,按5000~7000个/cm3接种,接种后4~5天可以达到95%融合,融合95%以上所述间充质干细胞可以扩增至20代次以上;消化时间短,消化过程对细胞的损伤小,接种密度可以很好的控制细胞的生长周期,按此种消化,接种密度传代羊膜间充质干细胞可以扩增20代次以上。

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