[发明专利]一种深层土中噬菌体的分离方法

说明书

本发明涉及一种深层土中噬菌体的分离方法，包括如下步骤：(1)将土壤样品与悬浮液混合，超声震荡处理，离心，取上清液，制得噬菌体初提液；(2)将噬菌体初提液经滤膜过滤，制得噬菌体提取液；(3)将噬菌体提取液经超滤膜离心过滤，去除滤出液，制得噬菌体浓缩液；(4)将噬菌体浓缩液、宿主菌菌液和缓冲液混合后，静置，离心，取上清，经滤膜过滤，取滤液，制得噬菌体。本发明不只是可有效分离深层土的噬菌体，还大大提高了噬菌体分离的效率，并且操作简单、可行性强、成本低，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种深层土中噬菌体的分离方法，属于微生物分离技术领域。

背景技术

噬菌体是由Frederick W.Twort和Felix d’Herelle于1915年和1917年分别发现，是可感染细菌等原核微生物的病毒。现在的研究发现，噬菌体是地球上数量最多的生命体，数量级达到10¹³，分布于生物圈的所有角落。可根据其生活史，将噬菌体分为烈性噬菌体和溶源性噬菌体两大类。烈性噬菌体可以通过裂解宿主菌，繁殖子代噬菌体。溶源性噬菌体则可在某些条件下选择进入溶源循环，将自身的基因组整合进宿主菌的基因组中和宿主菌稳定共存，在受到外界刺激时又可转入裂解循环，裂解宿主菌。

因为噬菌体所具有的裂解宿主菌的特性，利用噬菌体治疗细菌性感染已被广泛研究，这种治疗方法被称作噬菌体疗法。因为抗生素的存在，现在噬菌体疗法并未被大量应用。但随着病原菌抗生素耐药性的日益严重和超级细菌的不断出现，传统的抗生素治疗已受到严重挑战。噬菌体疗法也越来越受到科学家的重视。

噬菌体疗法的关键点在于分离尽量多的噬菌体。到目前为止，已有大量的噬菌体被分离测序，但它们的数量和自然界中的实际数量相比还有较大差距。并且这些被分离的噬菌体大多数来自于浅层土和水体，从深层土中分离噬菌体的数目太少。

中国专利文献CN104312984A(申请号201410593832.9)公开了一种水中噬菌体的分离方法，主要通过正电荷硅胶颗粒制备、洗脱以及噬菌体分离等步骤，高效的分离水环境中极低浓度的噬菌体。

中国专利文献CN109750026A(申请号201910061904.8)公开了一种筛选噬菌体的前处理方法。首先，向处于生长对数期的目标菌株发酵液中按照一定的质量百分比添加海藻酸钠、聚二甲基硅氧烷、低聚异麦芽糖和纳基膨润土，搅拌混匀至完全溶解，然后，利用滴液发生器将上述溶液滴至氯化钙溶液中形成微球，回收微球并将其置于真空冷冻干燥机中干燥，将冻干微球置于噬菌体分离原液中孵育，同时使用磁力搅拌器保持噬菌体分离原液的流动性，回收微球，并将微球置于研钵中，向研钵中加入PBS溶液，研磨至微球溶解在PBS溶液中，将溶解后的溶液过0.22微米孔径滤膜，收集滤过液，滤过液即为目标菌株的噬菌体富集液。

中国专利文献CN104849249A(申请号201510215442.2)公开了一种利用荧光显微镜测定土壤中噬菌体丰度的优化方法。通过分别利用pH 8.0的1×TE缓冲溶液、10％Tween80和10mM的焦磷酸钠等试剂对土壤中腐植酸处理从而制备出土壤悬浮液，并采取了对样品不同倍数的稀释，然后进行样品的染色和制片，在荧光显微镜下观察制片效果，利用荧光显微镜测定样品核酸荧光强度及土壤中的噬菌体丰度准确分析，结果表明用10％Tween80和10mM的焦磷酸钠同时处理样品并对样品稀释10倍时制片效果最好，测得的噬菌体丰度较高。本发明的方法制样简单，准确性高，重复性好，操作简便快速，为噬菌体丰度的快速测定提供了方法依据。