[发明专利]一种全身性Plin1基因敲除动物模型构建及鉴定方法

权利要求书

1.一种全身性Plin1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于：所述方法基于CRISPR/Cas9基因敲除技术，包括以下步骤：

（1）针对Plin1基因2号外显子前后序列设计1对sgRNA序列，通过构建Plin1基因敲除载体及体外转录获得sgRNA；

（2）将sgRNA与Cas9蛋白混合组成的Cas9 sgRNA体系的小鼠受精卵显微注射，F₀代小鼠出生及鉴定，F₀代小鼠性成熟配繁，F₁代小鼠鉴定，F₁代阳性小鼠雌雄近交获得F₂代小鼠，即为全身性Plin1基因敲除小鼠；

所述sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；

所述sgRNA的筛选及获得方法为：

（1）针对小鼠Plin1基因2号外显子序列，在NCBI中查询小鼠Plin1基因的基本信息，应用在线工具http://crispr.mit.edu设计识别Plin1基因2号外显子前后的sgRNA序列对；

（2）根据脱靶位点、基因数和发生错配的可能性大小进行评估筛选，选择1对sgRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2所示；

（3）选择CRISPR基因敲除质粒pX330作为载体，用限制性内切酶BBS切割pX330质粒BBS酶切位点即第245、267位置，使其线性化；

（4）向2条Plin1 sgRNA的5’端添加粘性末端后与线性化载体用T4 DNA连接酶进行连接，在pX330 gRNA scafflod位置加入sgRNA序列构建Plin1基因CRISPR/Cas9敲除载体Plin1-1，Plin1-2；构建好的质粒载体转化至DH5α菌群中，2 d后挑取单克隆菌落测序及限制性核酸内切酶ApaLI+NcoI双酶切法鉴定，载体序列信息如SEQ ID NO:3,4所示；

（5）按照sgRNA体外转录试剂盒即PC1380说明书设计正向引物SG1-F、SG2-F和通用下游引物SG-R，序列如SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7所示，PCR扩增转录模板后进行sgRNA转录，转录完全并纯化后进行琼脂糖凝胶电泳实验检测sgRNA片段大小及完整性。

2.根据权利要求1所述的一种全身性Plin1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于：所述的方法还包括鉴定Plin1基因敲除小鼠动物模型。

3.根据权利要求2所述的一种全身性Plin1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于：所述鉴定Plin1基因敲除小鼠动物模型的方法为：

A、待F₀代小鼠出生三周后，提取小鼠尾部DNA，利用引物F，R进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，测序鉴定基因型，引物序列如SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9所示；

B、选取F₀代阳性小鼠与野生型异性小鼠交配获的F₁代小鼠，利用引物F、Wt/He-R进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，测序鉴定基因型，引物序列如SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10所示；

C、选取F₁代阳性小鼠雌雄近交获得F₂代小鼠，按照F₀代小鼠基因型鉴定方法获得纯合型小鼠，即为小鼠动物模型。