[发明专利]一种全身性Plin1基因敲除动物模型构建及鉴定方法

说明书

本发明属生物技术领域，提供一种全身性Plin1基因敲除动物模型构建及其鉴定方法。构建方法步骤为：针对Plin1基因2号外显子前后序列设计sgRNA序列，构建Plin1基因敲除载体并进行体外转录获得sgRNA；将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射入小鼠受精卵中，获得全身性Plin1基因敲除小鼠。本项目的有益效果在于筛选出了一对评分最高的sgRNA序列，保证了项目的成功率；实现了Plin1基因2号外显子的大片段敲除，提高了敲除效率；针对敲除区域设计3条引物，成功鉴定出了小鼠的各类基因型，避免了大片段敲除时2条引物可能无法区分基因型的情况。为研究PLIN1的生物学功能及肥胖相关代谢性疾病的发病机制提供便捷、可靠、经济的动物模型和良好的基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种全身性Plin1基因敲除动物模型构建及其鉴定方法。

背景技术

随着经济的快速发展和人民生活水平的提高，肥胖已经成为日益严重的全球性健康问题。近年数十年来，全球超重和肥胖的发病率增长明显，并在发达国家和发展中国家中均呈快速蔓延之势。普遍认为，近年来生活环境的改变与肥胖症的发生有着直接的关系。不健康的饮食习惯，久坐的生活方式，缺乏运动，睡眠习惯以及文化和人口背景的变化均可能诱发肥胖。但在一项国外最新的研究中发现，遗传因素在生活环境的改变下可能在肥胖的发生中占据着主要地位。随着人类全基因计划和全基因组关联研究的日渐深入，发现了数十种与肥胖发生相关的基因，针对这些基因开展系列研究有助于全面理解肥胖的发病机制并可能为肥胖防治的提供潜在靶点。

Plin1基因位于人类15号染色体的q26区域，其DNA长度大于15 kb，包含9个外显子和8个内含子，其多个单核酸多态性位点会增加肥胖的发生风险，被认为是肥胖相关的候选基因。在哺乳动物中，Plin1基因在白色脂肪组织中高度表达，单拷贝编码完全定位于脂滴表面的围脂滴蛋白（perilipin1, PLIN1），对脂滴的生物合成具有十分重要的作用。PLIN1可以增强甘油三酯（triglyceride, TG）的合成并促进单房脂滴（直径≥10um）的形成，进而提高脂肪组织储存脂肪的能力。同时，PLIN1还可以通过与甘油三酯脂肪酶（adiposetriglyceride Lipase, ATGL）和激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase, HSL）相互作用，参与脂解的调节。最近还有研究表明，PLIN1可能也参与了脂肪组织中的炎症反应。目前，对于PLIN1的生物学功能虽尚未完全阐明，但已经发现其基因表达量下调与2型糖尿病、高血压、脂肪肝等多种代谢性疾病的发生密切相关，进一步研究Plin1基因的功能与作用对于阐明这些疾病的发病机制具有重要意义。

基因编辑技术是一种对靶基因进行定点改造的技术，在基因结构与功能研究、细胞的基因工程改造，动植物的新品种培育及疾病的基因治疗方面被广泛应用。近年来，得益于转基因技术的发展和疾病模型构建的需要，转基因动物成为基因编辑研究领域的一大热点。通过运用各种方法将外源基因导入动物的基因组内，外源基因片段即可实现对动物细胞染色体的的修饰，达到在转基因动物体内稳定遗传的目的。转基因动物模型的构建打破了自然界基因组序列的固有格局，使得人们可以更加深入的对基因的结构和功能进行研究，为基因及遗传信息的研究创造了更加广阔的平台。

CRISPR/Cas9技术是近年来新出现的一种基因编辑技术，与锌指核酸酶(ZFN)技术和类转录样效应因子核酸酶(TALEN)技术相比，因其操作简单、高效率和低成本的优势在基因编辑领域被广泛应用。