[发明专利]MiR-205-5p在制备血管新生剂中的应用

权利要求书

1.一种MiR-205-5p在制备血管新生剂中的应用，其特征在于，该应用是为以下操作：

S1、采用定量实时qRT-PCR检测miR-205-5p和CD31在人胃癌组织和肝转移瘤中的表达；

S2、通过体外检测人脐静脉内皮细胞毛细血管的形成和在体背侧皮肤皱褶室模型，研究miR-205-5p沉默和高表达的作用；

S3、采用qRT-PCR和western印迹检测miR-205-5p对VEGFA和FGF1表达的影响，MiR-205-5p通过ERK信号途径和直接靶向性下调VEGFA和FGF1的表达。

2.根据权利要求1所述的一种MiR-205-5p在制备血管新生剂中的应用，其特征在于，为了进一步确定miR-205-5p表达对体内血管生成的影响，采用不同类型的GC细胞克隆建立了异种移植模型，并采用免疫组化方法检测肝转移瘤和异种移植瘤的微血管密度，其中异种移植模型采用小老鼠模型。

3.根据权利要求1所述的一种MiR-205-5p在制备血管新生剂中的应用，其特征在于，所述S3中是采用双荧光素酶报告法证实FGF1的3'UTR与VEGFA的相互作用，且双荧光素酶报告法显示miR-205-5p直接靶向VEGFA和FGF1 mRNA的3'UTR，调控内源性VEGFA和FGF1的表达，所以VEGFA和FGF1是miR-205-5p的直接靶点，miR-205-5p通过靶向ERK信号通路和miRNA-mRNA直接相互作用调控内源性VEGFA和FGF1的表达。

4.根据权利要求1所述的一种MiR-205-5p在制备血管新生剂中的应用，其特征在于，所述S2中人脐静脉内皮细胞毛细血管的形成是指将基质凝胶用管道输送到预冷96孔板中，将人脐静脉内皮细胞培养在100微升条件培养基中，条件培养基取自不同种类的细胞，培养36小时后，拍摄毛细血管形成结构；

背侧皮肤皱褶室模型是指在实验对象完全麻醉后，通过皮下注射5ml空气在实验对象体内形成背侧气囊，将所得的不同类型的细胞注入扩散室，并将其置于皮下，10天后，这些实验对象在植入的腔室周围被仔细地剥皮，并在可见光下拍摄了覆盖房间的皮肤褶皱。

5.根据权利要求4所述的一种MiR-205-5p在制备血管新生剂中的应用，其特征在于，上述的不同类型细胞个数为1.0×106个，实验对象选择动物。

6.根据权利要求1所述的一种MiR-205-5p在制备血管新生剂中的应用，其特征在于，所述S3中qRT-PCR检测是采用Trizol试剂和miRNeasy-FFPE试剂盒分别从细胞系和石蜡包埋组织切片中提取总RNA；

为了检测miR-205-5p，用All-in-One将RNA反向转录成cDNA^TM miRNA第一链cDNA合成试剂盒，然后使用miRNA qRT-PCR检测试剂盒对microRNAs进行qRT-PCR；

为了检测mRNAs，使用GoScript逆转录系统，将RNA反向转录成cDNA，并使用qRT-PCR-Master Mix对mRNAs进行qRT-PCR；

所有qRT-PCR均采用ABI-Prism 7500系统，分别用U6或GAPDH作为microRNAs和mRNAs定量的内部对照。

7.根据权利要求1所述的一种MiR-205-5p在制备血管新生剂中的应用，其特征在于，所述S3中Western印迹检测是通过将FGF1、VEGFA和GAPDH抗体分别用于检测FGF1、VEGFA和GAPDH，而(p-)SAPK/JNK、(p-)ERK1/2和(p-)p-38抗体用于检测MAPK信号通路的激活；

其中，VEGFA为1：1000稀释，GAPDH为1：2000稀释，(p-)p-38为1：800稀释。