[发明专利]一种胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片及其制备方法

权利要求书

1.一种胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片，包括载玻片(1)，其特征在于：所述载玻片(1)通过方形阵列的方式分为多个微型阵列区域(2)，每个所述微型阵列区域(2)的内部均附着有羧基磁珠(3)，所述羧基磁珠(3)的内部交联有胶体金标记的抗肿瘤抗原特异性抗体(4)。

2.一种胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、胶体金制备：取1g氯金酸溶于50ml的水中，形成0.01％的氯金酸水溶液，取100mL至250mL烧杯中，加热至沸腾后，保持沸腾的状态下加入2.00～3.00ml的0.1mol/L柠檬酸钠，当氯金酸水溶液的颜色为稳定的红色后停止加热，待红色水溶液冷却至室温后，用100ml～200ml的蒸馏水恢复至原体积，即可得到胶体金；

S2、胶体金标记抗体：将待标记蛋白质置入透析袋内后直接放入双蒸馏水中透析，然后在4℃的环境下离心60分钟，取上清液；

S3、使用EDCNHS两步法的羧基磁珠与胶体金标记抗体交联：利用胶体金标记抗体缓冲液用200ml～250ml蒸馏水分馏置换并调整浓度，将胶体金标记抗体缓冲液置换为15mM MES6.0，将胶体金标记抗体浓度调整至2mg/mL～2.5mg/mL；

S4、在已准备好的载玻片上点样：对羧基磁珠与胶体金标记抗体胶交联后的样品进行点样，在每个微型阵列区域进行点样，点好的芯片经水化烘干后用PBS冲洗，烘干温度在80°～90°，烘干时间为10min～15min，再用1％的BSA封闭1小时，PBS冲洗，将载玻片放入盛有PBS玻璃染色缸中，浸泡5min～7min即可，吹干后即制得胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片。

3.根据权利要求2所述的一种胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将根据S2中的操作步骤，通过光电比色法确定标记蛋白最适稳定量为30～60μg/ml，形成蛋白质溶液，调节胶体金pH至6.0～6.5，在胶体金中加入最适稳定量的蛋白质溶液，然后对溶液进行离心，离心后形成沉淀物，将沉淀物溶于PEG2000缓冲液中，制成胶体金标记抗体。

4.根据权利要求2所述的一种胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片的制备方法，其特征在于，根据S3之后，还包括以下步骤：

S31、羧基磁珠活化：取10mg羧基磁珠，使用15mM MES 6.0清洗3次，将羧基磁珠复悬于0.1mL的15mM MES 6.0至羧基磁珠浓度为100mg/mL，称取EDCSulfo－NHS并溶解于15mMMES 6.0中，EDC浓度为20mg/mL，Sulfo－NHS浓度为24mg/ml，取50μL EDC，50μL Sulfo－NHS加入到清洗后的羧基磁珠中，立即混匀，羧基磁珠浓度为50mg/mL，25℃混匀状态下活化30min；

S32、羧基磁珠与胶体金标记抗体交联：活化好的羧基磁珠去上清液，加入冷的15mMMES 6.0 1mL进行清洗，共清洗2次，取调整浓度后的胶体金标记抗体200μL(浓度为2mg/mL)加入到活化好的羧基磁珠中，立即混匀，25℃混匀条件下，反应12－18小时；

S33、交联后封闭及保存：反应结束后，羧基磁珠去上清，加入缓冲液10mMPBS7.4+0.1％Tween20至羧基磁珠浓度为10mg/mL进行清洗，重复清洗2次；加入缓冲液10mMPBS7.4+0.1％Tween20+0.1％BSA+0.01％Casein至羧基磁珠浓度为10mg/mL，室温条件下混匀反应30min，将羧基磁珠去上清，并复悬于缓冲液10mMPBS7.4+0.1％Tween20+0.1％BSA中，终浓度为10mg/mL，交联完成。