[发明专利]一种产反式乌头酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种产反式乌头酸的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程领域。化学合成反式乌头酸存在副产物多，工艺复杂等缺点，为了克服反式乌头酸的生产缺陷，本发明构建一种产反式乌头酸的基因工程菌，是将At‑∆cadA土曲霉中的细胞色素P450单加氧酶基因CICC_3028g进行基因突变得到重组土曲霉菌，利用重组土曲霉菌株发酵生产反式乌头酸的含量比At‑∆cadA土曲霉生产的反式乌头酸含量显著提高。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种产反式乌头酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

乌头酸（丙烯-1，2，3-三羧酸，1,2,3-Propenetricarboxylic acid）因从乌头属植物中提取而得名，是一种不饱和三羧酸。因其含有不饱和双键和丰富的羟基，因此可以作制备聚合材料的单体化合物，也可以作为其他化合物的合成前体，如三甲基反式乌头酸等。乌头酸有顺、反式两种构型，其中，顺乌头酸(CAS:585-84-2)是三羧酸循环中乌头酸酶催化柠檬酸异构化生成异柠檬酸的中间产物。顺乌头酸可被顺乌头酸脱羧酶CadA催化降解生成衣康酸。乌头酸酶作为三羧酸循环中的关键酶，抑制乌头酸酶活性可以干扰三羧酸循环，从而影响生命活动。

反式乌头酸（trans-Aconitic acid，CAS：4023-65-8）为顺式乌头酸的立体异构体，可以作为竞争性抑制剂干扰乌头酸酶活性，从而产生特殊的生理功能。反式乌头酸还有诸多生物活性，有研究表明反式乌头酸具有显著的抗水肿作用；可以抑制利什曼原虫的生长，从而作为治疗黑热病的药物；具有抑制褐飞虱取食的活性；在线虫防治等方面具有较好的效果，在生物农药开发方面很好的潜力。目前，反式乌头酸主要是通过化学合成的方法生产，工艺复杂，副产物多，成本高，而且没有形成规模化生产，反式乌头酸的有效供应将促进下游应用和产品开发的主要因素。

发明内容

为了可以生产反式乌头酸，本发明提供了一种基因工程菌株，是以无顺式乌头酸脱羧酶CadA表达的土曲霉菌株（Aspergillus terreus）为出发菌株，将出发菌株中细胞色素P450单加氧酶或者细胞色素P450单加氧酶直系同源基因进行突变所得到的。

进一步地限定，所述的出发菌株为将顺乌头酸脱羧酶CadA进行基因缺失突变而获得的土曲霉，或为不存在编码顺乌头酸脱羧酶CadA的基因的土曲霉。

进一步地限定，所述的顺式乌头酸脱羧酶CadA在NCBI的登录号是 GenBank：EAU29420.1。

进一步地限定，构建所述出发菌株的宿主菌为土曲霉CICC40205，土曲霉NRRL1960，土曲霉DSM23081，土曲霉TN484或土曲霉TN484-M1。

本发明还提供了细胞色素P450单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码细胞胞色素P450单加氧酶基因是CICC_3028g，其序列如SEQID NO.2所示。

本发明还提供了一种所述的基因工程菌株的构建方法，所述的构建方法是将无顺式乌头酸脱羧酶CadA表达的土曲霉中的细胞色素P450单加氧酶基因进行突变，构建重组土曲霉。

进一步地限定，所述的构建方法具体步骤包括：

1) 细胞色素P450单加氧酶基因打靶元件构建：以土曲霉CICC40205的基因组为模板，PCR扩增获得细胞色素P450单加氧酶基因CICC_3028g基因的上游同源臂片段与下游同源臂片段，作为打靶元件；

2) 将步骤1）中得到的CICC_3028g打靶元件导入无顺式乌头酸脱羧酶CadA表达的土曲霉，筛选后获得产反式乌头酸的基因工程菌株。