[发明专利]检验SLC可以维持成年睾丸中Leydig和肌样细胞体内稳态的方法

权利要求书

1.一种检验SLC可以维持成年睾丸中Leydig和肌样细胞体内稳态的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，试验动物的处理：选用90天雄性SD大鼠，向所述SD大鼠腹腔内注射乙烯二甲基磺酸盐(EDS，80mg/kg体重)，经EDS处理后四天，通过麻醉处死SD大鼠；

步骤二，生精小管的分离与培养：将去白膜睾丸组织置于DMEM/F12培养基中，在透射照明解剖显微镜下，将生精小管与间质组织机械分离，等长截取5cm的生精小管，在生精小管培养基中培养，在34℃和5％CO₂下长达4周，所述生精小管培养基包含有LH(10ng/ml)或PDGF-AA(10ng/ml)或PDGF-BB(10ng/ml)或TGFB(10ng/ml)中一种或多种试剂，在实验结束时，收集培养基并在-20℃条件下冷冻，对部分生精小管进行HSD3B活性染色或固定以进行CYP11A1、desmin、ACTA2或层粘连蛋白免疫荧光染色，对剩余生精小管-80℃冷冻保存以用于蛋白质印迹；

步骤三，SLCs的分化与增殖：设置第一周时间为增殖期，设置第二至四周时间为分化期。在增殖期中，除添加PDGF-AA或PDGF-BB外，不添加其它试剂。在分化期中，含有LH(10ng/ml)及PDGF-AA(10ng/ml)的培养基用于Leydig细胞的培育，含有TGFB(10ng/ml)及PDGF-BB(10ng/ml)的培养基用于肌样细胞的培育，并用Click-iT EdU试剂盒标记生精小管表面的分裂细胞。将部分用PDGF-AA(10ng/ml)或PDGF-BB(10ng/ml)处理6天后的生精小管用EdU(10μM)标记24小时，在荧光显微镜下观察生精小管表面的Click-iT阳性细胞，并定量计数。沿生精小管表面计数阳性细胞数量，以每平方单位表达阳性细胞数；将另一部分用EdU标记的生精小管固定在10％福尔马林中，保持15min后，包埋在石蜡中并切片，在完成EdU标记后，用层粘连蛋白抗体对切片后的生精小管的基底膜复染，对生精小管进行了CYP11A1和/或HSD3B染色以测量Leydig细胞谱系的分化，对生精小管进行结蛋白或ACTA2染色以确定肌样细胞谱系的分化；

步骤四，免疫荧光和HSD3B活性染色：在EDS处理后的第7天，检查SD大鼠睾丸细胞的PDGFRα和PDGFRβ的表达，将SD大鼠睾丸用福尔马林固定并包埋在石蜡中，用含0.5％BSA的无Ca2+/Mg2+的HBSS洗涤生精小管以及睾丸切片，然后与一抗培育60min，再与二抗培育30min；然后用荧光二抗处理组织1小时，清洗后，用尼康Eclipse 800显微镜检查组织，并用普林斯顿仪器5-Mhz cooled CCd相机拍摄，制作CRI彩色滤光片并用IP-实验室数字图像分析软件进行分析，对生精小管中HSD3B进行酶染色；

步骤五，蛋白质印记分析：用Tris-HCl缓冲液，以裂解组织或细胞，在18,000g下高速离心10min后，将上清液与3X SDS上样缓冲液混合，通过10％SDS-PAGE分离每个样品中等量的总蛋白，再转移到硝酸纤维素膜上，与1：1000的一抗以及用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的1：5000二抗培养后，采用化学发光蛋白质印迹试剂盒检测信号；采用抗体剥离缓冲液剥离硝酸纤维素膜上结合的抗体，并采用CYP11A1、ACTA2、desmin、层粘连蛋白和β-肌动蛋白抗体重新探测硝酸纤维素膜。

2.根据权利要求1所述的一种检验SLC可以维持成年睾丸中Leydig和肌样细胞体内稳态的方法，其特征在于：步骤一中，所述SD大鼠饲养温度保持为22℃，并每隔12小时进行一次光暗切换，并为SD大鼠提供随意取用的水和食物。

3.根据权利要求1所述的一种检验SLC可以维持成年睾丸中Leydig和肌样细胞体内稳态的方法，其特征在于：步骤一中，所述EDS由80mg/kg体重溶解在DMSO：PBS为1：3的溶剂中制得。

4.根据权利要求1所述的一种检验SLC可以维持成年睾丸中Leydig和肌样细胞体内稳态的方法，其特征在于：步骤二中，所述生精小管培养基设置为1∶1混合的M199和DMEM/F12，并添加有0.1％BSA，15mM HEPES，2.2mg/ml碳酸氢钠，青霉素/链霉素(100U/ml和100μg/ml)和胰岛素/转铁蛋白/硒(ITS)。