[发明专利]用于小片段核酸纯化筛选的方法

说明书

本发明公开了一种用于小片段核酸纯化筛选的方法。该方法包括以下步骤：利用核酸纯化磁珠通过控制PEG8000和异丙醇百分比浓度配比进行第一轮纯化，收取磁珠上清液回收Nnt以下的核酸片段，其中，N100。本发明的技术方案适用于100nt/bp以下的小片段核酸纯化筛选，只需几步纯化和洗脱过程即可完成，过程简单、用时短、高效、成本较低，适用广泛。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于小片段核酸纯化筛选的方法。

背景技术

在高通量测序建库过程中，AMpure XP磁珠(Beckman coulter)是最常见的片段纯化筛选工具，主要由可逆化固相载体磁珠、20％聚乙二醇(PEG8000)和2.5M氯化钠(NaCl)组成，磁珠表层的羧基在不同PEG和盐离子浓度环境下可将不同长度的DNA片段吸附到磁珠表面；在适当条件下，DNA可从磁珠表面洗脱下来。基于上述原理，AMpure XP磁珠通常用于文库PCR扩增后的纯化，以及高通量测序建库中目的片段的筛选，包括引物和二聚体的去除等；然而，商品化磁珠的纯化筛选范围通常在150nt/bp以上，而对100nt/bp以下的小片段核酸纯化筛选通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis；PAGE)跑胶和切胶回收来完成，过程繁琐、耗时长且需要使用试剂盒完成。

100nt/bp以下的核酸片段使用PAGE胶切胶回收进行纯化，其缺点主要有：

(1)PAGE胶成分由聚丙烯酰胺、Tris盐酸(Tris-HCl)，十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵和四甲基乙二胺(TEMED)组成；其中，SDS是一种表面活性剂，对人体微毒；过硫酸铵对皮肤有强烈刺激，且具有腐蚀性；TEMED具有强腐蚀性，易燃且高毒性；

(2)PAGE胶的制备、跑胶及切胶回收过程需要2-3个小时以上；同时，手动切胶还需要凝胶成像系统辅助；

(3)切胶获得的小片段凝胶需要购买商品化的纯化柱进行回收提取。

发明内容

本发明旨在提供一种用于小片段核酸纯化筛选的方法，以解决现有技术中小片段核酸纯化筛选过程繁琐的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于小片段核酸纯化筛选的方法。该方法包括以下步骤：利用核酸纯化磁珠通过控制PEG8000和异丙醇(Sigma，59304-100ML-F)百分比浓度配比进行第一轮纯化，收取磁珠上清液回收N nt以下的核酸片段，其中，N100。

进一步地，方法还包括：利用核酸纯化磁珠通过控制PEG8000和异丙醇百分比浓度配比对磁珠上清液进行第二轮纯化，回收核酸纯化磁珠上所吸附的核酸片段，核酸片段的长度大于M nt，NM。

进一步地，调整PEG8000百分比浓度在6％～7.5％之间，异丙醇百分比浓度在31％～35％之间，采用XP磁珠进行第一轮纯化，吸附65nt及65nt以上的核酸片段，收取磁珠上清液回收65nt以下核酸片段。

进一步地，调整PEG8000百分比浓度在6％-8.5％之间，异丙醇浓度在38％～41％之间，采用XP磁珠进行第二轮纯化，吸附45nt及45nt以上的核酸片段。

进一步地，对获取的核酸片段进行凝胶电泳验证。

进一步地，在第一轮纯化之前还包括：核酸样本起始量的确定：设计不同长度的单链DNA序列，制备25～95nt不同长度DNA的混合液，评估预定基础磁珠体积、预定PEG8000和异丙醇的百分比浓度条件下核酸样本最佳起始量。

进一步地，在第一轮纯化之前还包括：固定异丙醇百分比浓度，设置不同PEG8000百分比浓度，评估PEG8000对小片段核酸纯化的效果，确定合适的核酸片段长度范围。

进一步地，固定异丙醇百分比浓度为35％。