[发明专利]用于大肠杆菌与志贺菌甄别的试剂盒

说明书

本发明提供了用于大肠杆菌和志贺菌甄别的试剂盒，涉及基于质谱的病原体甄别检测技术领域。本发明将生化方法和质谱技术相结合，根据大肠杆菌、志贺菌各自的生化特性，确定两个特征蛋白的质荷比m/z分别为103.12±0.1、89.10±0.1，结合生化试剂盒反应液，通过MALDI‑TOF MS检测这两个特征峰，可准确判断待检测的样本是大肠杆菌还是志贺菌，同时并确定是否为宋内志贺菌。本发明试剂盒含有生化试剂、反应液、标准校正液，方法准确度高、重复性好，通量高，检测成本低廉，结果可靠，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及蛋白质谱检测技术领域，具体地，涉及用于甄别大肠杆菌和志贺菌并鉴定宋内志贺菌的试剂盒。

背景技术

致病性大肠杆菌共包括5类，分别为肠出血性大肠杆菌（EHEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）和凝聚性大肠杆菌（EAEC）。志贺菌根据生化反应和O抗原不同，分为4个血清群，即痢疾志贺菌（A群）、福氏志贺菌（B群）、鲍氏志贺菌（C群）、宋内志贺菌（D群）。大肠杆菌与志贺菌有密切的亲缘关系，在遗传学上非常接近、遗传信息相似，因此，区分大肠杆菌与志贺菌以及志贺菌的四个种群非常困难，但意义重大。从传染病防治法的角度，大肠杆菌引起的腹泻属于丙类中的其他感染性腹泻病，而志贺菌引起的细菌性痢疾属于乙类传染病，报告和处理要求均不相同。因此大肠杆菌与志贺菌的甄别鉴定十分重要，快速、准确的区分甄别意义重大。宋内志贺菌和福氏志贺菌是我国分离株的主要菌群，我国6年内的志贺菌分离株中，宋内志贺菌与福氏志贺菌的分离率为92.3%，这两个种群的快速区分，对我国志贺菌病的诊断与防治具有重要意义。

大肠杆菌与志贺菌区分鉴定主要依靠传统的系统生化方法，志贺菌采用血清学进行种群的区分。目前，全基因组测序技术、16S rRNA等分子生物学方法也用于大肠杆菌与志贺菌的区分以及志贺菌各个血清群的甄别鉴定。全球范围内高端技术体系的发展为细菌识别鉴定提供了有利的工具。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术已经发展近10余年，在微生物识别鉴定领域的应用已趋于成熟，其快速、准确、易操作、廉价、高通量的特点已得到全世界范围的认同。但直接采用商业化的MALDI-TOF MS技术无法区分大肠杆菌与志贺菌是业内公知的常识，研究者采用在商业化系统数据库内大量增加标准参考菌谱的方式、采用MALDI-TOF MS结合ClinProTools软件的方式以及MALDI-TOF MS 结合人工神经网络分析的方法进行大肠杆菌与志贺氏菌的区分，识别能力较原商业化系统有所提高，达到90-94%的区分能力。但这些方法还是基于菌株本身的核糖体蛋白，采用的与商业化系统相同的样本处理方式，只是在分析方法上进行的改进。志贺氏菌种内仍无法用MALDI-TOF MS区分。也有研究者通过宋内志贺的四个特征蛋白峰（5612.81±8.7、4871.12±45.9、4164.03±26、3247.05±6.9）来区分宋内志贺和大肠杆菌，该方法采用24株宋内志贺菌，采集了480张图，构建了标准参考谱，并将标准参考谱中与大肠杆菌的标准谱相比较得到的四个特异峰作为两者鉴定判别的标准。然而采用该方法存在两个问题，一是该方法是基于宋内志贺菌本身的核糖体蛋白采用MALDI-TOF MS 的常规手段进行手动操作进行区分，工作量繁琐且复杂，采用现行的MALDI-TOF MS结合ClinProTools软件方法完全可以更高效地筛选获得宋内志贺的特征蛋白峰，并替代该技术，且对宋内志贺菌核糖体蛋白筛选的覆盖面更广，另一个问题是，特征蛋白峰以5612.81±8.7等来表征，这种表征方式在本领域内是不正确的，例如5612.81是质荷比峰值，8.7是信噪比，两个不同的单位数值进行加减是不合理的，且由于信噪比不是定值，每一张谱图都不完全相同，不能将质荷比（质量的大小）加减信噪比（信号强度的比值）；用这四个蛋白也无法区分宋内志贺和大肠杆菌，更无从谈及志贺菌种群的区分。