[发明专利]一种口蹄疫病毒致弱突变株及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种口蹄疫病毒致弱突变株及其制备方法和应用，属于生物技术和生物制品技术领域。口蹄疫病毒致弱突变株是将亲本口蹄疫病毒前导蛋白基因中的Lb AUG突变为ATC或AAA，突变病毒在BHK‑21细胞中的复制能力与亲本毒株相似，但在PK‑15细胞上的复制水平降低，对乳鼠的致病力显著减弱，而且此突变类型能够稳定遗传。本发明在OZK/93‑08疫苗株基因组结构基础上将前导蛋白基因中的第2个起始密码子AUG突变为ATC或AAA后，能显著致弱O型口蹄疫病毒，是一种研制基因工程弱毒疫苗株的方法，将为口蹄疫O型灭活疫苗抗原的生产提供一个更安全的平台。

技术领域

本发明属于生物技术和生物制品技术领域，具体涉及一种口蹄疫病毒致弱突变株及其制备方法和应用。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起的一种急性、热性、高度传染性的动物疫病，主要侵染偶蹄类动物，包括牛，猪，绵羊和山羊等。该病是世界动物卫生组织(OIE)法定报告的动物传染病之一，我国将其列为一类动物疫病之首。目前，对口蹄疫最有效的控制策略主要是通过接种灭活疫苗以及屠宰感染和暴露的动物来实现的。欧盟和南美的一些国家经过几十年免疫接种口蹄疫病毒灭活疫苗，已经有效控制了口蹄疫，被认为是灭活疫苗防控口蹄疫的标杆。我国在2012年5月发布的《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中，明确将口蹄疫列为优先防控的疫病，将疫苗免疫作为防控和净化的核心技术手段。

灭活疫苗的生产需要昂贵的设施，在这些设施中大量增殖口蹄疫病毒强毒株，存在病毒从生产设施中逃逸的风险。为了降低疫苗制造过程中散毒的生产隐患，方法之一是开发生物安全性提高的口蹄疫病毒株。这种工程毒株在BHK-21细胞(用于口蹄疫疫苗生产的种子细胞系)中的复制能力不应降低，但在其它干扰素全能型细胞中的复制能力减弱或者对敏感动物的致病力减弱，即致弱毒株。因此，从“种毒”源头改造口蹄疫疫苗强毒株，获得致弱病毒株，对于提高疫苗生产过程中的生物安全性至关重要。

前导(leader,L)蛋白是一种木瓜蛋白酶样蛋白酶，是口蹄疫病毒编码的毒力因子，在口蹄疫病毒发病机理中起着重要的作用。因此，对前导蛋白基因的操纵可能获得工程可行的口蹄疫病毒致弱毒株。前导蛋白的翻译起始于两个不同的起始密码子(Lab AUG和LbAUG)，间隔84个核苷酸(La区域)，这导致前导蛋白存在两种形式，称为Lab蛋白和Lb蛋白。起始密码子的选择利用是影响病毒蛋白翻译起始的核心步骤之一，决定着病毒蛋白的翻译效率，所以L基因中两个起始AUG对口蹄疫病毒复制起着重要的作用。先前的研究已经分析了两个起始AUG的突变对病毒复制的影响，结果表明Lab AUG突变为UGG并不妨碍口蹄疫病毒的拯救，但是Lb AUG突变为UUU则拯救不到活的口蹄疫病毒。另一项研究表明，La区域内插入57nt的转座子导致Lb AUG的利用率降低，使得病毒对牛的致病力减弱。此外，La区域中插入表位标签(Flag)不会影响病毒的存活，但会消除或大大降低病毒利用Lab AUG起始蛋白翻译活动。这些已有的结果表明，Lab AUG和Lb AUG的选择使用对于口蹄疫病毒的复制和致病力非常关键。迄今为止，国内外尚无可用的Lb AUG修饰的口蹄疫病毒，也没有Lb AUG修饰口蹄疫致弱毒株的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种口蹄疫病毒致弱突变株，所述突变株病毒具有致弱表型，对于提高疫苗生产中的生物安全性具有应用潜力。

本发明提供了一种口蹄疫病毒致弱突变株，将口蹄疫病毒前导蛋白基因中的LbAUG突变为ATC或AAA。

优选的，突变为ATC的前导蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

优选的，突变为AAA的前导蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。

优选的，所述前导蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。