[发明专利]一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用

权利要求书

1.靶向斑马鱼csf1ra基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA的序列为SEQ ID NO.1~5所示的核苷酸序列。

2.一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：

1) 设计并合成识别csf1ra基因靶位点的sgRNA序列，所述的sgRNA序列为SEQ ID NO.1~5所示的核苷酸序列；

2) 将所述的sgRNA序列和Cas9 mRNA共同注射到斑马鱼受精卵中，培养获得稳定遗传的csf1ra基因缺失斑马鱼突变体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1) 具体包括：查询斑马鱼csf1ra基因序列及功能结构域，结合CRISPR/Cas9敲除原理，设计并合成sgRNA序列，在sgRNA识别序列前添加T7启动子，后方添加sgRNA骨架，以此为模板，用T7 RNA聚合酶进行sgRNA体外转录。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2) 中所述的Cas9 mRNA是按照以下步骤获得的：以T7驱动的人源化Cas9编码序列为模板，用T7 RNA聚合酶进行Cas9体外转录，然后戴帽并加polyA尾。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2) 中所述的斑马鱼受精卵为1-4细胞期受精卵，显微注射剂量为1nL，其中sgRNA的注射浓度为50ng/μL，Cas9 mRNA的注射浓度为250ng/μL。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，培养获得稳定遗传的csf1ra基因缺失斑马鱼突变体包括以下步骤：

1) 将经过注射的受精卵培养至成鱼，得到F0代csf1ra基因缺失的斑马鱼；

2) 将得到的F0代csf1ra基因缺失的斑马鱼与野生型斑马鱼交配得到F1代斑马鱼，并鉴定F1代csf1ra基因缺失的斑马鱼；

3) 将得到的F1代csf1ra基因缺失的雌性和雄性斑马鱼进行杂交得到F2代斑马鱼，并鉴定纯合的F2代csf1ra基因缺失的斑马鱼。

7.权利要求1所述的sgRNA在构建csf1ra基因缺失斑马鱼突变体中的应用。

8.根据权利要求2-6中任一项所述的制备方法制备得到的csf1ra基因缺失斑马鱼突变体在csf1ra基因功能研究中的应用。