[发明专利]一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用

说明书

本发明公开了一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用，本发明利用CRISPR/Cas9技术设计csf1ra基因敲除sgRNA靶点，首次成功构建了csf1ra基因缺失斑马鱼突变体，此外，本发明的突变体生物模型可用于csf1ra基因功能机制的深入研究，包括csf1ra基因在神经系统发育中的作用研究。

技术领域

本发明涉及基因敲除技术领域，更具体地，涉及csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备和应用。

背景技术

集落刺激因子受体(colony stimulating factor 1receptor，CSF1R)是III型受体型酪氨酸激酶血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)家族的一员，存在于人类、小鼠、大鼠、斑马鱼等物种中。生理情况下，CSF1R通过与配体IL-34的结合影响单核/巨噬细胞的增殖、分化及存活等行为。病理情况下，CSF1R的异常表达与多种疾病密切相关。在造血系统中，CSF1R的突变可引发骨髓增生异常综合征和急性巨核细胞白血病等疾病；在非造血系统中，CSF1R过表达可见于多种实体肿瘤，参与恶性肿瘤的增殖、转移和微环境调控等。因此，拓展对CSF1R功能的认识，对于深入理解其在相关疾病发生发展中的作用具有重要的意义。

成簇规律间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease(Cas)，CRISPR/Cas)是细菌或古细菌在应对噬菌体长期选择压力下形成的一种获得性免疫防御机制，能够识别自身和外源入侵的DNA片段。CRISPR/Cas系统主要分为3种类型：I型、II型和III型，其中II型CRISPR/Cas系统含有标志性Cas9蛋白，即CRISPR/Cas9系统。Cas9蛋白具有核酸内切酶活性，能够识别并切割DNA双链，当噬菌体入侵机体时，在向导RNA(single guide，sgRNA)指导下，Cas9蛋白对外源DNA进行切割形成双链DNA缺口，断裂的双链激活DNA损伤修复机制，再通过同源重组修复和非同源末端连接修复机制对断裂DNA进行修复，以实现靶基因的敲入和敲除。CRISPR/Cas9系统具有作用高效、成本低廉、操作简单等优势，被广泛应用于精确和靶向性基因编辑。

在斑马鱼，CSF1R由csf1ra基因编码，在早期巨噬细胞即可表达。巨噬细胞首先在卵黄囊中分化，随后进入头部间质并迁移定植于大脑、视网膜等部位。在迁移过程中，进入头部的一部分巨噬细胞会转化为小胶质细胞，成为中枢神经系统最主要的免疫细胞。因此，小胶质细胞由外周的造血组织分化而来，迁移至中枢神经系统后在相对封闭的脑部环境中维持自我增殖与分化，维持神经系统的稳态。本发明利用斑马鱼这一模型生物，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对其基因组进行编辑，实现目的基因的定位敲除，从而获得csf1ra基因敲除斑马鱼突变体，这将为后续的疾病建模和分子机制研究方面提供基础。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用，以斑马鱼为生物模型，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对其基因组进行编辑，实现目的基因的定位敲除，从而获得csf1ra基因敲除斑马鱼突变体。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的第一个方面提供了靶向斑马鱼csf1ra基因的sgRNA。

进一步，所述的sgRNA序列包括SEQ ID NO.1～5所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种csf1ra基因敲除方法，其特征在于，设计识别csf1ra基因靶位点的sgRNA序列，所述的sgRNA序列与核酸酶结合并引导核酸酶结合到csf1ra基因靶位点处，核酸酶对靶位点处的序列进行随机剪切，通过细胞自身的非同源末端连接修复机制修复csf1ra基因双链，造成移码突变，完成csf1ra基因被敲除。