[发明专利]一种制备和鉴定雄性配子体不育的方法

说明书

本发明公开了一种制备和鉴定雄性配子体不育的方法，将可能的雄性配子体功能相关基因的下调表达元件，同直观的花青素性状相关基因或基因片段连入同一个植物表达载体，在转基因后代中，根据花青素相关性状是否随雄配子传递而判断相关基因是否为雄配子体不育相关基因，和雄配子体不育是否制备成功。本发明的方法具有通用、直观、高效和准确的优点，在分离、鉴定雄性配子体不育相关基因，制备雄性配子体不育，繁殖孢子体不育等方面具有重要作用。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种制备和鉴定雄性配子体不育的方法与应用，还涉及水稻芽鞘紫线基因的改造基因OsMYB76R，上述方法、基因和应用相关的植物表达载体。

背景技术

植物雄性不育在花粉发育研究和杂种优势研究中具有重要的作用。雄性不育包括孢子体不育和配子体不育。孢子体不育受植株本身的基因型控制，花药中的所有花粉都不育，在田间通常表现花药形态、颜色、大小异常，不结实，很容易发现和鉴定；孢子体不育基因既可通过雌配子在世代间传递，也可通过雄配子在世代间传递。而配子体不育受花粉基因型控制，花药中一半花粉可育，另一半花粉不育，其花药在田间同野生型相比无明显差异，结实也正常，难以直接发现和鉴定；雄配子体不育基因只能通过雌配子传递。由于上述差异，使得雄配子体不育的制备、发现和鉴定非常困难，需要结合室内的显微观察、PCR和电泳等手段进行，客观上造成配子体不育材料稀少，相关基础和应用研究滞后于孢子体不育。花青素性状在植物中肉眼可见，在各器官均可表现。转录因子基因OsMYB76是花青素合成调控必需基因，而花粉特异或高表达基因同雄配子体的正常功能密切相关，将花青素合成调控必需基因同抑制雄配子体功能相关基因的元件连锁，开发一种简单易行的制备和鉴定雄性配子体不育的方法具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供制备和鉴定雄性配子体不育的方法，为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

将可能的雄性配子体功能相关基因的下调表达元件，同直观的花青素性状相关基因或基因片段连锁转入植物中，在转基因后代中，根据花青素相关性状是否随雄配子传递而判断相关基因是否为雄配子体不育相关基因，和雄配子体不育是否制备成功。

具体包括以下步骤：

(1)根据基因表达数据(在线表达数据库，文献中的基因表达数据，或自行进行花药或花粉转录组测序、基因芯片或RT-qPCR等)分析，初步确定在花粉中表达的基因为雄性配子体不育相关基因的候选基因，如有冗余基因同时起作用，需同时对冗余基因进行下调或敲除。本发明实施例选用的是水稻基因Loc_Os05g40740，也可选用其他雄配子体发育相关基因，选用其他雄配子体发育相关基因不限制本发明专利所申明的权利要求的保护；下调冗余基因也不限制本发明的权利要求。

(2)根据候选基因序列与基因结构分析，构建候选基因Loc_Os05g40740下调表达载体 pXi。本发明实施例采用的是干涉，干涉片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；干涉用的启动子为花粉表达启动子，优选为花粉特异表达启动子，更优选为候选基因本身启动子，本发明使用Loc_Os05g40740本身启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；终止子是Tnos。

(3)改造水稻花青素合成必须基因OsMYB76序列：通过碱基替换和人工合成，去掉序列中的常用酶切位点，得到OsMYB76R。将人工合成的OsMYB76R置于35S等组成性启动子，或OsMYB76基因本身的启动子，或胚乳等特异性启动子下游，Tnos等终止子上游，将获得的启动子+OsMYB76R基因+终止子区段同上述Loc_Os05g40740基因的干涉片段连接，获得载体pXi-OsMYB76R。本发明在OsMYB76R基因两边用的是35S启动子和Tnos终止子。