[发明专利]一种嗜酸性PGPR菌株的筛选、鉴定及其生防活性方法

权利要求书

1.一种嗜酸性PGPR菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：嗜酸性PGPR菌株筛选

(1)将营养琼脂培养基平板pH调为5.5进行嗜酸细菌的筛选；

(2)根际土样悬浮液不做80℃热处理。

步骤二：不同酸碱度条件下菌株抑菌活性测定

(1)供试菌株发酵液制备如下：将活化的菌株接种于1.1中不同pH的NB中，28℃、150r/min振荡培养24h后在紫外分光光度计下调整浓度为108CFU/mL、不同pH条件的标准菌液。

(2)不同酸碱度条件下菌株发酵液抑菌活性测定

琼脂扩散法测定菌株发酵液抑菌活性：取对数期108CFU/mL青枯菌菌液均匀喷雾平板，琼脂孔中加入50μL菌株发酵液，阴性对照为等量相同pH的NB培养基，28℃培养48h后观察，十字交叉法测量抑菌带宽度。

(3)酸性条件下菌株无菌滤液对青枯菌抑制作用

无菌滤液制备：菌株标准菌液按体积比1％分别接种于pH5.5的NB中，28℃、150r/min振荡培养48h后的发酵液低温条件下5000r/min离心5min后，上清液经细菌过滤器除菌获得无菌滤液。

(4)琼脂扩散法测定菌株无菌滤液抑菌活性：取对数期108CFU/mL青枯菌菌液均匀喷雾平板，琼脂孔中加入50μL菌株无菌滤液，阴性对照为等量相同pH的NB培养基，28℃培养48h后观察，十字交叉法测量抑菌带宽度。

(5)菌株无菌滤液对菌体的影响采用透射电镜观察法：分别取10mL菌株无菌滤液与1mL青枯菌发酵液混合培养，空白对照是10mLNB培养基，每个处理3个重复。

2.根据权利要求1所述的一种嗜酸性PGPR菌株的筛选方法，其特征在于：经酸性平板初筛试验的抑菌圈大小获得抑菌活性较好的10株拮抗细菌；拮抗活性最好菌株17。

3.根据权利要求1所述的一种嗜酸性PGPR菌株的筛选方法，其特征在于：通过菌体和无菌上清液拮抗活性和稳定性重复试验，获得拮抗活性和稳定性最强的菌株17，其发酵液和无菌上清液均对青枯菌较好的抑制效果，抑菌带宽分别为9.39±1.67amm和7.00±1.00amm。

4.一种嗜酸性PGPR菌株的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：BIOLOG鉴定

将菌株鉴定培养基上33℃培养24h，按照操作规程将微生物细胞浓度调至90％～98％T，将菌悬液倒入V型加样水槽中，用8通道电动移液器按每孔100μL的量将菌悬液按顺序加入微孔板的所有孔中，33℃黑暗培养，在培养4～6h和16～24h时用读数仪读取菌株的特征性碳源代谢指纹特征，结果与BIOLOG数据库中的菌株进行比对分析，获得鉴定结果。

步骤二：分子鉴定

按照细菌基因组提取试剂盒操作步骤提取菌株基因组DNA，采用16SrDNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃90s，35次循环；72℃7min，PCR扩增产物交由上海派森诺生物科技股份有限公司测序，将16SrDNA基因序列，进行序列分析和系统发育树构建。

5.根据权利要求1所述的一种嗜酸性PGPR菌株的鉴定方法，其特征在于：BIOLOG鉴定，BIOLOG板微孔菌株代谢测定结果显示，培养24h后，菌株能利用a-D-葡萄糖、D-山梨醇、L-丙氨酸、甘油、L-天门冬氨酸、柠檬酸、L-谷氨酸和蔗糖，该菌株代谢特征与枯草芽孢杆菌相似度较高，其可能性、相似性和位距分别为0.960、0.66和5.051，为枯草芽孢杆菌。

6.根据权利要求1所述的一种嗜酸性PGPR菌株的鉴定方法，其特征在于：菌株16SrDNA基因序列长度为1417bp，在GenBank中分别进行BLAST同源性比对，基于16SrDNA基因序列构建2个菌株系统发育树，菌株与枯草芽孢杆菌B.subtilis同源性为99.0％。